若干鈣調控蛋白在小鼠ES細胞衍生神經元內質網鈣儲存及神經發(fā)生中的作用.pdf

1、鈣離子在細胞膜和內質網(endoplasmicreticulum,ER)膜之間的流動對神經元的基礎功能發(fā)揮著關鍵性的作用,而內質網作為胞內重要的鈣儲存細胞器,參與調節(jié)胞內鈣平衡,調控各種信號通路,介導細胞蛋白合成、信號傳導等過程。本實驗以小鼠胚胎干(embryonicstem,ES)細胞體外定向分化神經元為模型,模擬胚胎神經發(fā)育過程,考察若干鈣調控蛋白在小鼠ES細胞衍生神經元內質網鈣儲存及神經發(fā)生中的作用。
　　 內質網中的鈣離

2、子動態(tài)平衡過程由蘭尼堿受體(ryanodinereceptors,RyRs)、IP3受體(inositol1,4,5-triphosphatereceptors,IP3Rs)以及肌(內)質網Ca2+-ATP酶(sarcoplasmiCreticulumCa2+-ATPase,SERCA)協(xié)調運作控制。其中,SERCA蛋白能量依賴性的鈣回調作用對內質網鈣平衡至關重要。本實驗考察了ES細胞神經元分化過程中內質網鈣儲存及鈣釋放特征,并探索SE

3、RCA在神經元功能性發(fā)育中潛在作用及可能的分子機制。
　　 Junctophilins(JPs)是一類被證實存在于興奮期細胞中的C2+平衡調控蛋白,神經細胞表達Junctophilin3(JP-3),Junctophilin4(JP-4)兩種亞型。Jp-3,Jp-4基因敲除小鼠特征性表現(xiàn)出運動協(xié)調功能失常、平衡能力損傷并伴有記憶損傷。本研究利用ES細胞體外分化為神經元模型,探索Jp-3,Jp-4在胚胎神經發(fā)育過程中的作用。

4、>　　 目的:探索小鼠胚胎干細胞神經分化過程中內質網鈣儲存及鈣釋放特征,并探索內質網鈣泵蛋白SERCA在神經元功能性發(fā)育中潛在的作用。
　　 方法:采用經典的4-/4+法誘導小鼠ES細胞定向分化為神經元,10-7mol/L全反式維甲酸(Retinoicacid,RA)為陽性對照,0.1％二甲基亞砜(DMSO)為溶劑對照。在分化培養(yǎng)終點(貼壁鋪展培養(yǎng)d8+10),光鏡和免疫熒光成像法鑒定神經元形成(軸突長度是胞體長度的3倍及以上

5、),細胞微管蛋白(β-tubulinⅢ)陽性。分別收集ES細胞、擬胚體(embryoidbodies,Ebs)、貼壁培養(yǎng)d8+0、d8+5和d8+10細胞樣本,以RT-PCR及Western-blot法,評價內質網相關鈣調控蛋白RyRs、IP3受體及SERCA在各個神經分化時期表達特征。以神經前體細胞標志蛋白(nestin),成熟神經元標志蛋白(β-tubulinⅢ),神經軸突標志蛋白(neurofilaments,NEFM)和神經樹突

6、標志蛋白(microtubule-associatedprotein2,MAP2)表達評價分化情況;FM1-43熒光染色觀察分化成熟神經元囊泡攝取功能。選取分化早期d8+3神經前體細胞及d8+10分化成熟神經元,經由活細胞工作站檢測其內質網鈣釋放功能。以10-6mol/L,SERCA抑制劑(cyclopiazonicacid,CPA)論證SERCA對神經分化的特定作用。觀察CPA是否影響RA促神經分化作用及神經元囊泡攝取功能。同時利用W

7、estern-blot法檢測MAPK通路中ERK,INK,p38磷酸化等相關分子事件的變化,以探索RA促神經分化過程SERCA的可能機制。
　　 結果:小鼠ES細胞定向分化神經元過程中,內質網鈣相關蛋白SERCA、RyRs和IP3Rs表達均隨分化時相依賴性上調。神經前體細胞即具有內質網鈣釋放功能,成熟神經元中此功能進一步增強。SERCA抑制劑CPA能顯著減少RA促ES細胞分化為神經細胞,抑制神經元軸突和樹突發(fā)育,并抑制神經元囊泡

8、攝取功能。提示SERCA具有調控神經分化作用,特別體現(xiàn)在促軸突和樹突發(fā)育以及囊泡攝取功能。CPA可下調MAPK通路中ERK,JNK和p38的磷酸化,提示內質網鈣儲存對神經分化調節(jié)作用尚伴隨MAPK家族蛋白的激活。
　　 結論:RA促小鼠ES細胞定向分化神經過程,呈現(xiàn)內質網鈣儲存及釋放功能,該功能存在于神經細胞分化早期,且隨分化進程呈上調趨勢。抑制SERCA鈣離子泵功能,不僅降低內質網鈣儲存,尚呈現(xiàn)抑制神經分化作用,特別是影響軸突

9、和樹突發(fā)育,并抑制了神經囊泡攝取功能。神經分化過程中SERCA活性伴有MAPK家族蛋白磷酸化參與。
　　 第二章Jp-3,Jp-4基因對小鼠ES細胞衍生神經元胚層發(fā)育、線粒體表達及神經遞質分泌的影響
　　 目的:探索ES細胞衍生神經元Ca2+平衡調控蛋白基因(Junctophilin3,Junctophilin4,Jp-3,Jp-4),在神經分化中的作用,及其與神經元線粒體功能和神經遞質分泌功能的關系。
　　 方

10、法:小鼠ES細胞神經分化早期,小干擾Jp-3,Jp-4(siRNA),收集鋪展分化培養(yǎng)d8+0、d8+2、d8+6、d8+8各時期細胞樣本,RT-PCR法考察分化相關基因DCT3/4(未分化ES細胞標志基因)、Fgf5(外胚層發(fā)育標志基因)、Brachy(中胚層發(fā)育標志基因)、AFP(內胚層發(fā)育標志基因)、nestin(神經前體細胞標志基因)的表達。貼壁培養(yǎng)d8+0、d8+5、d8+10(神經分化終點)各時期,評價線粒體融合蛋白基因Mf

11、n1、Mfn2,過氧化物酶增殖激活受體輔酶激活因子PGC1-α及核呼吸因子NRF-1的表達特征。MitoTracker*Red標記活細胞線粒體,細胞免疫化學檢測siJp-3,Jp-4神經元線粒體完整性。RT-PCR法檢測神經細胞分化終點相關神經遞質標志性蛋白泡狀谷氨酸鹽轉運體(vesicularglutamatetransporters,VGluT1),谷氨酸脫羧酶(glutamatedecarboxylase65,GAD65),乙酰膽

12、堿酯酶(Acetylcholinesterase,AChE)基因表達。
　　 結果:siJp-3,siJp-4可顯著降低外胚層Fgf5轉錄,部分減少神經前體細胞nestin轉錄,對其他胚層相關基因表達則影響不明顯。siJp-3,siJp-4尚可損傷線粒體完整性,表現(xiàn)為線粒體熒光強度降低,且在軸突和樹突內分布減少。siJp-3,siJp-4抑制了線粒體結構與功能基因Mfn1、Mfn2、PGC1-α及NRF-1的轉錄。同時,siJp