白介素17A通過(guò)脊髓神經(jīng)元CaMKII-CREB信號(hào)通路致神經(jīng)病理性疼痛的機(jī)制研究.pdf

1、本文分四個(gè)部分進(jìn)行探討：
　　第一部分：結(jié)扎小鼠不同脊神經(jīng)制備的脊神經(jīng)結(jié)扎模型的比對(duì)研究
　　目的：比較結(jié)扎小鼠L4或L5脊神經(jīng)制備的脊神經(jīng)結(jié)扎模型（SNL）的造模效果。
　　方法：解剖C57BL/6J小鼠坐骨神經(jīng)，比較L4、L5脊神經(jīng)不同。C57BL/6J小鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組（Sham）、L4脊神經(jīng)結(jié)扎組（L4）及L5脊神經(jīng)結(jié)扎組（L5），術(shù)后比較各組小鼠后足改變。各組小鼠于手術(shù)前（基線）、術(shù)后第1、3、5、7、14

2、天分別測(cè)定機(jī)械痛敏壓力閾值（PWMT）及熱刺激縮足反射潛伏期（PWTL）。術(shù)后第3、7天各取3只，取脊髓腰膨大，蛋白電泳檢測(cè)術(shù)側(cè)脊髓p-CREB的表達(dá)。
　　結(jié)果：C57BL/6J小鼠坐骨神經(jīng)由部分L3神經(jīng)、L4神經(jīng)、L5神經(jīng)組成，L4神經(jīng)最粗，L5神經(jīng)細(xì)長(zhǎng)。Sham組及L5組小鼠術(shù)后步態(tài)、姿勢(shì)無(wú)明顯改變。L4組小鼠術(shù)側(cè)后爪內(nèi)收畸形，休息時(shí)術(shù)側(cè)后爪經(jīng)常處于保護(hù)姿勢(shì)。L4組小鼠的PWMT及PWTL較L5組低。L4組術(shù)后3天及7天脊髓

3、p-CREB表達(dá)較L5組明顯上調(diào)。
　　結(jié)論：結(jié)扎L4脊神經(jīng)制作的SNL模型更簡(jiǎn)單、痛敏更明顯，更符合理想疼痛模型。
　　第二部分：IL-17A在小鼠神經(jīng)病理性疼痛中的作用
　　目的：研究IL-17A在L4脊神經(jīng)結(jié)扎（SNL）模型脊髓的表達(dá)情況及脊髓IL-17A在神經(jīng)病理性疼痛的中的作用。
　　方法：C57BL/6J小鼠SNL后第1、3、5、7、14天各取3只，取脊髓腰膨大，蛋白電泳檢測(cè)術(shù)側(cè)脊髓IL-17A及GF

4、AP的表達(dá)趨勢(shì)，第7天灌注處死3只，冰凍切片免疫熒光雙標(biāo)檢測(cè)脊髓腰膨大IL-17A/GFAP共表達(dá)情況。野生型C57BL/6J小鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(Sham)、脊神經(jīng)結(jié)扎組（WTSNL），IL-17A基因敲除小鼠組結(jié)扎L4神經(jīng)(IL-17A-/-SNL)。各組小鼠于手術(shù)前（基線）、術(shù)后第1、3、5、7、14天分別測(cè)定機(jī)械痛閾值和熱痛閾值，術(shù)后第7天各組取3只，取脊髓腰膨大，蛋白電泳檢測(cè)術(shù)側(cè)脊髓IL-17A、GFAP。鞘內(nèi)置管+SNL后第

5、7天的C57BL/6J小鼠隨機(jī)分為注射溶劑組（Vehicle）、IL-17A中和抗體組（Anti-IL-17A），鞘內(nèi)注射后1小時(shí)及2小時(shí)檢測(cè) PWMT及PWTL。鞘內(nèi)置管后小鼠隨機(jī)分為Vehicle組、重組IL-17A組（rIL-17A，50ng）組、rIL-17A（100ng）組。鞘內(nèi)注射后1小時(shí)及2小時(shí)檢測(cè)PWMT及PWTL。鞘內(nèi)置管后小鼠隨機(jī)分為Vehicle組、rIL-17A（100ng）組、rIL-17A+Anti-IL-1

6、7A組。鞘內(nèi)注射后1小時(shí)及2小時(shí)檢測(cè)PWMT及PWTL。
　　結(jié)果：同Sham比較，SNL后1、3、5、7、14天IL-17A及GFAP表達(dá)增高。脊髓IL-17A和GFAP免疫熒光共表達(dá)。同野生型比較，IL-17A-/- SNL組小鼠脊髓GFAP表達(dá)減少。SNL后，IL-17A基因敲除、中和內(nèi)源性 IL-17A可以明顯提高機(jī)械痛閾及熱痛閾。正常小鼠鞘內(nèi)注射100ng rIL-17A明顯誘發(fā)小鼠機(jī)械痛及熱痛，中和抗體抵消所誘發(fā)的熱痛

7、。
　　結(jié)論：脊神經(jīng)結(jié)扎后，IL-17A由活化的脊髓星型膠質(zhì)細(xì)胞分泌并促進(jìn)神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生及維持。
　　第三部分：CREB磷酸化在IL-17A痛覺(jué)信號(hào)通路的作用
　　目的：在本研究旨在確定IL-17A是否通過(guò)磷酸化CREB促進(jìn)神經(jīng)病理性疼痛的痛覺(jué)過(guò)敏。
　　方法：C57BL/6J小鼠SNL后第1、3、5、7、14天各取3只，取脊髓腰膨大，蛋白電泳檢測(cè)術(shù)側(cè)脊髓p-CREB，第7天灌注處死3只，冰凍切片免疫熒光雙

8、標(biāo)檢測(cè)脊髓腰膨大p-CREB/NeuN共表達(dá)情況。野生型C57BL/6J小鼠隨機(jī)分為Sham及WTSNL兩組，加17A-/- SNL組，術(shù)后第7天各組取3只，取脊髓腰膨大，蛋白電泳檢測(cè)術(shù)側(cè)脊髓p-CREB。鞘內(nèi)置管+SNL后第7天的C57BL/6J小鼠隨機(jī)分為Vehicle組、Anti-IL-17A組。注藥后2小時(shí)取脊髓腰膨大，蛋白電泳檢測(cè)術(shù)側(cè)脊髓p-CREB。鞘內(nèi)置管后小鼠隨機(jī)分為Vehicle組、rIL-17A（50ng）組、rIL

9、-17A（100ng）組。鞘內(nèi)注射后2小時(shí)取脊髓腰膨大，蛋白電泳檢測(cè)術(shù)側(cè)脊髓p-CREB。鞘內(nèi)置管后小鼠隨機(jī)分為Vehicle組、rIL-17A（100ng）組、rIL-17A+Anti-IL-17A組。鞘內(nèi)注射后2小時(shí)取脊髓腰膨大，蛋白電泳檢測(cè)術(shù)側(cè)脊髓p-CREB。原代培養(yǎng)的脊髓神經(jīng)元第7天，隨機(jī)分為Vehicle組、rIL-17A（10ng）組、rIL-17A（100ng）組。rIL-17A刺激后15分鐘細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)p-CREB

10、表達(dá)。原代培養(yǎng)的脊髓神經(jīng)元隨機(jī)分為Vehicle組、rIL-17A（100ng）組、rIL-17A+Anti-IL-17A組，rIL-17A刺激后15分鐘細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)p-CREB表達(dá)。
　　結(jié)果：同假手術(shù)組比較，SNL后1、3、5、7、14天p-CREB表達(dá)增高。免疫熒光提示脊髓p-CREB/NeuN共表達(dá)。IL-17A基因敲除、中和內(nèi)源性IL-17A可以明顯降低脊神經(jīng)結(jié)扎所致p-CREB高表達(dá)，正常小鼠鞘內(nèi)注射rIL-17A

11、增加脊髓p-CREB表達(dá)，以注射100ng后2小時(shí)后表達(dá)明顯，中和抗體可以減少rIL-17A所致p-CREB表達(dá)。100ng rIL-17A刺激原代培養(yǎng)的脊髓神經(jīng)元 p-CREB表達(dá)明顯，中和抗體可以減少rIL-17A所致p-CREB表達(dá)。
　　結(jié)論：IL-17A通過(guò)促進(jìn) CREB的磷酸化參與了脊神經(jīng)結(jié)扎致神經(jīng)病理性疼痛的產(chǎn)生與維持
　　第四部分：CaMKII磷酸化在IL-17A/CREB信號(hào)通路中的作用
　　目的：本

12、研究旨在研究CaMKII磷酸化在IL-17A/CREB疼痛信號(hào)通路的作用。
　　方法：野生型C57BL/6J小鼠隨機(jī)分為Sham及WTSNL，C57BL/6J背景的IL-17A基因敲除小鼠結(jié)扎L4神經(jīng)(17A-/-SNL)，術(shù)后第7天取脊髓腰膨大，蛋白電泳檢測(cè)術(shù)側(cè)脊髓 p-CaMKII。鞘內(nèi)置管+SNL后第7天的C57BL/6J小鼠隨機(jī)分為 Vehicle組、Anti-IL-17A組，鞘內(nèi)注射后2小時(shí)取脊髓腰膨大，蛋白電泳檢測(cè)術(shù)側(cè)

13、脊髓p-CaMKII。鞘內(nèi)置管后小鼠隨機(jī)分為Vehicle組、rIL-17A（50ng）組、rIL-17A（100ng）組，鞘內(nèi)注射后2小時(shí)取脊髓腰膨大，蛋白電泳檢測(cè)術(shù)側(cè)脊髓p-CaMKII。鞘內(nèi)置管后小鼠隨機(jī)分為Vehicle組、rIL-17A（100ng）組、rIL-17A+Anti-IL-17A組，鞘內(nèi)注射后2小時(shí)取脊髓腰膨大，蛋白電泳檢測(cè)術(shù)側(cè)脊髓 p-CaMKII。鞘內(nèi)置管+SNL后第7天的C57BL/6J小鼠隨機(jī)分為溶劑組、K

14、N93組，鞘內(nèi)注射后1小時(shí)及2小時(shí)測(cè)PWMT及PWTL，2小時(shí)后取脊髓腰膨大，蛋白電泳檢測(cè)術(shù)側(cè)脊髓p-CREB及p-CaMKII。鞘內(nèi)置管后小鼠隨機(jī)分為溶劑組、rIL-17A（100ng）組、rIL-17A（100ng）+KN93組，鞘內(nèi)注射后1小時(shí)及2小時(shí)測(cè)PWMT及PWTL，2小時(shí)后取脊髓腰膨大，蛋白電泳檢測(cè)術(shù)側(cè)脊髓p-CREB及p-CaMKII。原代培養(yǎng)的脊髓神經(jīng)元隨機(jī)分為溶劑組、rIL-17A（100ng）組、rIL-17A（1

15、00ng）+KN93組，預(yù)先30分鐘給KN93，rIL-17A刺激后15分鐘細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)p-CREB表達(dá)。
　　結(jié)果：IL-17A基因敲除、中和內(nèi)源性IL-17A可以明顯降低脊神經(jīng)結(jié)扎所致p-CaMKII高表達(dá)，正常小鼠鞘內(nèi)注射rIL-17A增加脊髓p-CaMKII表達(dá)，以注射100ng后2小時(shí)后表達(dá)明顯，中和抗體可以減少rIL-17A所致p-CaMKII表達(dá)。SNL鼠鞘內(nèi)注射KN93后減輕痛敏，抑制p-CaMKII、p-CR