人工合成E-選擇素對(duì)實(shí)驗(yàn)性兔頸總動(dòng)脈瘤模型中NF-κB、MCP-1表達(dá)的影響及意義.pdf

1、第一部分：實(shí)驗(yàn)性兔頸總動(dòng)脈瘤模型的建立及NF-κB、MCP-1在模型中的表達(dá)變化
　　 背景及目的：顱內(nèi)動(dòng)脈瘤(imracranial aneurysm，IA)是顱內(nèi)動(dòng)脈管壁病理性局限性擴(kuò)張產(chǎn)生的腦血管瘤樣突起，好發(fā)于顱底動(dòng)脈環(huán)(Willis環(huán))的大動(dòng)脈分叉或分支處。顱內(nèi)動(dòng)脈瘤破裂出血是自發(fā)性蛛網(wǎng)膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage，SAH)最主要的原因，嚴(yán)重危害人類(lèi)健康。為提供臨床病因治療的有效依據(jù)，深入

2、研究顱內(nèi)動(dòng)脈瘤的病因和發(fā)病機(jī)制顯得尤為迫切和重要。探討動(dòng)脈瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程對(duì)臨床治療意義重大，須依賴(lài)于建立可信的動(dòng)脈瘤模型。我們用彈性蛋白酶(elastase，EA)滴注法成功誘導(dǎo)出實(shí)驗(yàn)動(dòng)物動(dòng)脈瘤模型，該方法易重復(fù)，成本低，其效果總體上優(yōu)于靜脈移植、動(dòng)脈局部結(jié)構(gòu)破壞和血管內(nèi)介入等方法，形態(tài)及病理特點(diǎn)更接近人體顱內(nèi)動(dòng)脈瘤。近年來(lái)關(guān)于炎癥機(jī)制參與動(dòng)脈瘤形成過(guò)程的研究越來(lái)越深入，國(guó)內(nèi)外腹主動(dòng)脈瘤的研究表明，各種炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)導(dǎo)致了動(dòng)脈管壁彈

3、力纖維和膠原纖維的損傷和破壞，在浸潤(rùn)的炎性細(xì)胞中，以巨噬細(xì)胞的作用最為突出，而單核細(xì)胞趨化蛋白-1(monocyte chemotactic protein-1，MCP-1)對(duì)巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)有著重要的調(diào)節(jié)作用，核轉(zhuǎn)錄因子(nuclear factor-κB，NF-κB)則在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控了MCP-1等促炎癥基因的表達(dá)。我們擬對(duì)模型動(dòng)脈瘤壁中NF-κB、MCP-1的動(dòng)態(tài)表達(dá)進(jìn)行研究，探討其可能的發(fā)病機(jī)制，為顱內(nèi)動(dòng)脈瘤的病因治療提供良好的實(shí)驗(yàn)

4、依據(jù)。
　　 方法：(1)新西蘭大白兔24，口、，雌雄各半，隨機(jī)分成4組，A組(對(duì)照組)，B、C、D組為實(shí)驗(yàn)組(其中B組為1周組，C組為2周組，D組為3周組)，每組6只，自由攝水和進(jìn)食，室溫20～25℃，獨(dú)籠飼養(yǎng)。(2)游標(biāo)卡尺測(cè)量兔右頸總動(dòng)脈(commoncarotid artery，CCA)分叉處近端約0.5cm～1.0cm處頸總動(dòng)脈直徑，在手術(shù)顯微鏡下輕柔地撕去該部血管表面的纖維結(jié)締組織，抽取50u/ml的彈性蛋白酶0.2

5、ml滴注其表面，對(duì)照組用PBS滴注，20min后通過(guò)兔耳緣靜脈緩慢推注肝素納500u。(3)1周后行兔頸總動(dòng)脈系統(tǒng)CT血管造影(CTA)分別檢測(cè)對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組兔右側(cè)頸總動(dòng)脈滴注局部血管的形態(tài)變化和動(dòng)脈瘤形成情況。(4)按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組，從手術(shù)日起每隔1周處死一組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，處死前測(cè)量動(dòng)脈瘤的頸寬、瘤高，取下頸總動(dòng)脈瘤標(biāo)本。(5)對(duì)標(biāo)本進(jìn)行HE染色和光鏡檢查。(6)一部分標(biāo)本進(jìn)行免疫組化染色，對(duì)NF-κB和MCP-1蛋白表達(dá)情況進(jìn)行研究。(

6、7)對(duì)另一部分進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-timePCR)檢測(cè)NF-κB和MCP-1mRNA表達(dá)情況。
　　 結(jié)果：(1)影像學(xué)檢查大體測(cè)量結(jié)果顯示：1周后兔頸總動(dòng)脈系統(tǒng)CTA檢查發(fā)現(xiàn)，18只實(shí)驗(yàn)兔均發(fā)現(xiàn)右側(cè)頸總動(dòng)脈作用血管段形成明顯的梭形或囊狀動(dòng)脈瘤，其中部分可見(jiàn)血栓形成，且有血管閉塞現(xiàn)象，對(duì)照組未發(fā)現(xiàn)動(dòng)脈瘤樣病變；在兔處死前用游標(biāo)卡尺測(cè)量動(dòng)脈瘤的頸寬、瘤高，C組分別與A、B組相比，動(dòng)脈瘤高度和寬度更大(p<0.05)，

7、C組與D組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)。(2)病理檢查結(jié)果顯示：實(shí)驗(yàn)組動(dòng)脈瘤瘤壁變薄，彈性纖維斷裂，平滑肌細(xì)胞減少并萎縮，降解明顯；對(duì)照組也有少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，但未觀(guān)察到彈力纖維降解和平滑肌退行性變。(3)免疫組化檢測(cè)結(jié)果顯示：NF-κB B、C、D組與A組相比表達(dá)均增加(p值分別<0.05，<0.05，<0.05)，其中B組與C組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)；MCP-1B、C、D組與A組相比表達(dá)均增加(p值分別<0

8、.05，<0.05，<0.05)，其中B組與C組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)。結(jié)果表明，NF-κB和MCP-1在A組未見(jiàn)表達(dá)，實(shí)驗(yàn)組于1周時(shí)表達(dá)達(dá)高峰，3周時(shí)均僅見(jiàn)少量表達(dá)，陽(yáng)性表達(dá)主要位于動(dòng)脈瘤壁血管內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和炎性細(xì)胞。(4)Real-time PCR檢測(cè)結(jié)果顯示：NF-κBB、C、D組與A組相比表達(dá)均增加(p值分別<0.05，<0.05，>0.05)，其中B組與C組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)；MCP

9、-1B、C、D組與A組相比表達(dá)均增加(p值分別<0.05，<0.05，>0.05)，其中B組與C組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)。
　　 結(jié)論：(1)彈性蛋白酶滴注法誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)性兔頸總動(dòng)脈動(dòng)脈瘤模型，方法簡(jiǎn)單可靠、成本低、易重復(fù)，形態(tài)及病理特點(diǎn)更接近人體顱內(nèi)動(dòng)脈瘤，可用于動(dòng)脈瘤的病因、發(fā)病機(jī)制和治療等方面的實(shí)驗(yàn)研究。(2)NF-κB的激活在顱內(nèi)動(dòng)脈瘤瘤壁炎癥反應(yīng)及病理變化過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，NF-κB的活化可能是顱內(nèi)動(dòng)脈

10、瘤發(fā)和發(fā)展的始動(dòng)因素之一。(3)MCP-1基因作為早期表達(dá)基因，其表達(dá)產(chǎn)物誘導(dǎo)了單核巨噬細(xì)胞在動(dòng)脈壁的粘附、浸潤(rùn)，進(jìn)一步使動(dòng)脈壁彈力纖維降解，促進(jìn)了顱內(nèi)動(dòng)脈瘤的發(fā)生、發(fā)展。
　　 第二部分人工合成E-選擇素對(duì)實(shí)驗(yàn)性免頸總動(dòng)脈瘤模型中NF-κB、MCP-1表達(dá)的影響及意義
　　 背景及目的：IA破裂造成的SAH是神經(jīng)外科最常見(jiàn)的危重急癥之一，其臨床起病急、病情進(jìn)展快、死亡率和致殘率極高，且其發(fā)病率呈逐年增高趨勢(shì)。隨著近年顯

11、微神經(jīng)外科和神經(jīng)介入技術(shù)的發(fā)展，動(dòng)脈瘤破裂患者的致死率和致殘率已明顯降低，但顱內(nèi)動(dòng)脈瘤患者的總體預(yù)后仍無(wú)較大程度改善。其主要原因是我們對(duì)顱內(nèi)動(dòng)脈瘤的發(fā)生、發(fā)展和破裂機(jī)制仍不完全清楚。因此，我們擬從顱內(nèi)動(dòng)脈瘤發(fā)病的炎癥機(jī)制的角度用藥物干預(yù)動(dòng)脈瘤形成過(guò)程，以預(yù)防動(dòng)脈瘤發(fā)生、抑制或延緩動(dòng)脈瘤發(fā)展、預(yù)防動(dòng)脈瘤破裂，進(jìn)行病因治療的研究。近年來(lái)，炎癥反應(yīng)促進(jìn)顱內(nèi)動(dòng)脈瘤發(fā)生發(fā)展的觀(guān)點(diǎn)被國(guó)內(nèi)外眾多研究者證實(shí)，而動(dòng)脈瘤抗炎治療方面的研究報(bào)道并不多見(jiàn)。本部

12、分在第一部分利用彈性蛋白酶滴注法誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)性兔頸總動(dòng)脈動(dòng)脈瘤模型的基礎(chǔ)上，應(yīng)用人工合成E-選擇素進(jìn)行干預(yù)，以觀(guān)察其對(duì)實(shí)驗(yàn)性兔頸總動(dòng)脈瘤壁NF-κB的激活和MCP-1的表達(dá)是否有抑制作用。
　　 方法：(1)新西蘭大白兔18只作為治療組，雌雄各半，隨機(jī)分成3組，分別為E、F、G組(其中E組為1周組，F(xiàn)組為2周組，G組為3周組)，每組6只，自由進(jìn)水和攝食，室溫20～25℃，獨(dú)籠飼養(yǎng)。(2)與第一部分相同，建立兔頸總動(dòng)脈瘤模型。(3)將

13、各組兔右側(cè)耳緣靜脈埋置24GY型靜脈留置針，將治療組兔耳緣靜脈注射人工合成E-選擇素1mg/(kg.d)，分別至第1、2、3周末處死。(4)1周后行兔頸總動(dòng)脈系統(tǒng)CTA分別檢測(cè)對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組兔右側(cè)頸總動(dòng)脈滴注局部血管的形態(tài)變化和動(dòng)脈瘤形成情況。(5)按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組，從手術(shù)日起每隔1周處死一組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，處死前測(cè)量動(dòng)脈瘤的頸寬、瘤高，取下頸內(nèi)動(dòng)脈瘤標(biāo)本。(6)對(duì)標(biāo)本進(jìn)行HE染色和光鏡檢查。(7)對(duì)標(biāo)本進(jìn)行免疫組化染色，對(duì)NF-κB和MCP

14、-1蛋白表達(dá)情況進(jìn)行研究。(8)對(duì)標(biāo)本進(jìn)行Real-time PCR檢測(cè)NF-κB和MCP-1 mRNA表達(dá)情況。
　　 結(jié)果：(1)影像學(xué)檢查和大體測(cè)量結(jié)果顯示：1周后兔頸內(nèi)動(dòng)脈系統(tǒng)CTA檢查發(fā)現(xiàn)，18只治療組兔右頸總動(dòng)脈作用血管段均發(fā)現(xiàn)有梭形或囊狀動(dòng)脈瘤形成，其中少部分瘤壁有血栓形成，E、F、G組分別與B、C、D組相比，其動(dòng)脈瘤高度和寬度均有不同程度減小(p值分別>0.05，<0.05，<0.05)，其中G組與F組相比，差異

15、無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)。(2)病理檢查結(jié)果顯示：E組動(dòng)脈瘤壁平滑肌細(xì)胞減少且萎縮，降解明顯，瘤壁變薄，彈性纖維斷裂；F、G組動(dòng)脈瘤血管壁平滑肌細(xì)胞辦有減少，但降解程度較輕，瘤壁稍變薄，彈性纖維輕度斷裂。(3)免疫組化檢測(cè)結(jié)果顯示：E、F、G組動(dòng)脈瘤壁NF.rd3的表達(dá)分別與B、C、D組相比均有減少，p值分別>0.05，<0.05，<0.05，其中G組與F組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)；E、F、G組動(dòng)脈瘤壁MCP-1的表達(dá)

16、分別與B、C、D組相比均有減少，p值分別>0.05，<0.05，<0.05，其中G組與F組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。表明人工合成E-選擇素在應(yīng)用2周后可明顯抑制NF-κB和MCP-1的表達(dá)。(4)Real-time PCR檢測(cè)結(jié)果顯示：E、F、G組動(dòng)脈瘤壁NF-κB的表達(dá)分別與B、C、D組相比均有減少，p值分別>0.05，<0.05，<0.05，其中G組與F組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)；E、F、G組動(dòng)脈瘤壁MC

17、P-1的表達(dá)分別與B、C、D組相比均有減少，p值分別>0.05，<0.05，<0.05，其中G組與F組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。同樣表明人工合成E.選擇素在應(yīng)用2周后可明顯抑制NF-κB和MCP-1的表達(dá)。
　　 結(jié)論：(1)人工合成E-選擇素可以延緩或抑制實(shí)驗(yàn)性兔頸總動(dòng)脈瘤瘤壁平滑肌細(xì)胞萎縮、減少以及彈性纖維斷裂，從而延緩或阻止動(dòng)脈瘤的病理發(fā)展過(guò)程。(2)人工合成E-選擇素對(duì)實(shí)驗(yàn)性兔頸總動(dòng)脈瘤瘤壁NF-κB的激活