人工合成E-選擇素對實驗性兔頸總動脈瘤模型中NF-κB、MCP-1表達的影響及意義.pdf

1、第一部分：實驗性兔頸總動脈瘤模型的建立及NF-κB、MCP-1在模型中的表達變化
　　 背景及目的：顱內動脈瘤(imracranial aneurysm，IA)是顱內動脈管壁病理性局限性擴張產生的腦血管瘤樣突起，好發(fā)于顱底動脈環(huán)(Willis環(huán))的大動脈分叉或分支處。顱內動脈瘤破裂出血是自發(fā)性蛛網膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage，SAH)最主要的原因，嚴重危害人類健康。為提供臨床病因治療的有效依據，深入

2、研究顱內動脈瘤的病因和發(fā)病機制顯得尤為迫切和重要。探討動脈瘤的發(fā)生、發(fā)展過程對臨床治療意義重大，須依賴于建立可信的動脈瘤模型。我們用彈性蛋白酶(elastase，EA)滴注法成功誘導出實驗動物動脈瘤模型，該方法易重復，成本低，其效果總體上優(yōu)于靜脈移植、動脈局部結構破壞和血管內介入等方法，形態(tài)及病理特點更接近人體顱內動脈瘤。近年來關于炎癥機制參與動脈瘤形成過程的研究越來越深入，國內外腹主動脈瘤的研究表明，各種炎性細胞的浸潤導致了動脈管壁彈

3、力纖維和膠原纖維的損傷和破壞，在浸潤的炎性細胞中，以巨噬細胞的作用最為突出，而單核細胞趨化蛋白-1(monocyte chemotactic protein-1，MCP-1)對巨噬細胞的浸潤有著重要的調節(jié)作用，核轉錄因子(nuclear factor-κB，NF-κB)則在轉錄水平調控了MCP-1等促炎癥基因的表達。我們擬對模型動脈瘤壁中NF-κB、MCP-1的動態(tài)表達進行研究，探討其可能的發(fā)病機制，為顱內動脈瘤的病因治療提供良好的實驗

4、依據。
　　 方法：(1)新西蘭大白兔24，口、，雌雄各半，隨機分成4組，A組(對照組)，B、C、D組為實驗組(其中B組為1周組，C組為2周組，D組為3周組)，每組6只，自由攝水和進食，室溫20～25℃，獨籠飼養(yǎng)。(2)游標卡尺測量兔右頸總動脈(commoncarotid artery，CCA)分叉處近端約0.5cm～1.0cm處頸總動脈直徑，在手術顯微鏡下輕柔地撕去該部血管表面的纖維結締組織，抽取50u/ml的彈性蛋白酶0.2

5、ml滴注其表面，對照組用PBS滴注，20min后通過兔耳緣靜脈緩慢推注肝素納500u。(3)1周后行兔頸總動脈系統(tǒng)CT血管造影(CTA)分別檢測對照組和實驗組兔右側頸總動脈滴注局部血管的形態(tài)變化和動脈瘤形成情況。(4)按照實驗動物分組，從手術日起每隔1周處死一組實驗動物，處死前測量動脈瘤的頸寬、瘤高，取下頸總動脈瘤標本。(5)對標本進行HE染色和光鏡檢查。(6)一部分標本進行免疫組化染色，對NF-κB和MCP-1蛋白表達情況進行研究。(

6、7)對另一部分進行實時熒光定量PCR(Real-timePCR)檢測NF-κB和MCP-1mRNA表達情況。
　　 結果：(1)影像學檢查大體測量結果顯示：1周后兔頸總動脈系統(tǒng)CTA檢查發(fā)現(xiàn)，18只實驗兔均發(fā)現(xiàn)右側頸總動脈作用血管段形成明顯的梭形或囊狀動脈瘤，其中部分可見血栓形成，且有血管閉塞現(xiàn)象，對照組未發(fā)現(xiàn)動脈瘤樣病變；在兔處死前用游標卡尺測量動脈瘤的頸寬、瘤高，C組分別與A、B組相比，動脈瘤高度和寬度更大(p<0.05)，

7、C組與D組相比，差異無統(tǒng)計學意義(p>0.05)。(2)病理檢查結果顯示：實驗組動脈瘤瘤壁變薄，彈性纖維斷裂，平滑肌細胞減少并萎縮，降解明顯；對照組也有少量炎性細胞浸潤，但未觀察到彈力纖維降解和平滑肌退行性變。(3)免疫組化檢測結果顯示：NF-κB B、C、D組與A組相比表達均增加(p值分別<0.05，<0.05，<0.05)，其中B組與C組相比，差異無統(tǒng)計學意義(p>0.05)；MCP-1B、C、D組與A組相比表達均增加(p值分別<0

8、.05，<0.05，<0.05)，其中B組與C組相比，差異無統(tǒng)計學意義(p>0.05)。結果表明，NF-κB和MCP-1在A組未見表達，實驗組于1周時表達達高峰，3周時均僅見少量表達，陽性表達主要位于動脈瘤壁血管內皮細胞、平滑肌細胞和炎性細胞。(4)Real-time PCR檢測結果顯示：NF-κBB、C、D組與A組相比表達均增加(p值分別<0.05，<0.05，>0.05)，其中B組與C組相比，差異無統(tǒng)計學意義(p>0.05)；MCP

9、-1B、C、D組與A組相比表達均增加(p值分別<0.05，<0.05，>0.05)，其中B組與C組相比，差異無統(tǒng)計學意義(p>0.05)。
　　 結論：(1)彈性蛋白酶滴注法誘導實驗性兔頸總動脈動脈瘤模型，方法簡單可靠、成本低、易重復，形態(tài)及病理特點更接近人體顱內動脈瘤，可用于動脈瘤的病因、發(fā)病機制和治療等方面的實驗研究。(2)NF-κB的激活在顱內動脈瘤瘤壁炎癥反應及病理變化過程中發(fā)揮著重要作用，NF-κB的活化可能是顱內動脈

10、瘤發(fā)和發(fā)展的始動因素之一。(3)MCP-1基因作為早期表達基因，其表達產物誘導了單核巨噬細胞在動脈壁的粘附、浸潤，進一步使動脈壁彈力纖維降解，促進了顱內動脈瘤的發(fā)生、發(fā)展。
　　 第二部分人工合成E-選擇素對實驗性免頸總動脈瘤模型中NF-κB、MCP-1表達的影響及意義
　　 背景及目的：IA破裂造成的SAH是神經外科最常見的危重急癥之一，其臨床起病急、病情進展快、死亡率和致殘率極高，且其發(fā)病率呈逐年增高趨勢。隨著近年顯

11、微神經外科和神經介入技術的發(fā)展，動脈瘤破裂患者的致死率和致殘率已明顯降低，但顱內動脈瘤患者的總體預后仍無較大程度改善。其主要原因是我們對顱內動脈瘤的發(fā)生、發(fā)展和破裂機制仍不完全清楚。因此，我們擬從顱內動脈瘤發(fā)病的炎癥機制的角度用藥物干預動脈瘤形成過程，以預防動脈瘤發(fā)生、抑制或延緩動脈瘤發(fā)展、預防動脈瘤破裂，進行病因治療的研究。近年來，炎癥反應促進顱內動脈瘤發(fā)生發(fā)展的觀點被國內外眾多研究者證實，而動脈瘤抗炎治療方面的研究報道并不多見。本部

12、分在第一部分利用彈性蛋白酶滴注法誘導實驗性兔頸總動脈動脈瘤模型的基礎上，應用人工合成E-選擇素進行干預，以觀察其對實驗性兔頸總動脈瘤壁NF-κB的激活和MCP-1的表達是否有抑制作用。
　　 方法：(1)新西蘭大白兔18只作為治療組，雌雄各半，隨機分成3組，分別為E、F、G組(其中E組為1周組，F(xiàn)組為2周組，G組為3周組)，每組6只，自由進水和攝食，室溫20～25℃，獨籠飼養(yǎng)。(2)與第一部分相同，建立兔頸總動脈瘤模型。(3)將

13、各組兔右側耳緣靜脈埋置24GY型靜脈留置針，將治療組兔耳緣靜脈注射人工合成E-選擇素1mg/(kg.d)，分別至第1、2、3周末處死。(4)1周后行兔頸總動脈系統(tǒng)CTA分別檢測對照組和實驗組兔右側頸總動脈滴注局部血管的形態(tài)變化和動脈瘤形成情況。(5)按照實驗動物分組，從手術日起每隔1周處死一組實驗動物，處死前測量動脈瘤的頸寬、瘤高，取下頸內動脈瘤標本。(6)對標本進行HE染色和光鏡檢查。(7)對標本進行免疫組化染色，對NF-κB和MCP

14、-1蛋白表達情況進行研究。(8)對標本進行Real-time PCR檢測NF-κB和MCP-1 mRNA表達情況。
　　 結果：(1)影像學檢查和大體測量結果顯示：1周后兔頸內動脈系統(tǒng)CTA檢查發(fā)現(xiàn)，18只治療組兔右頸總動脈作用血管段均發(fā)現(xiàn)有梭形或囊狀動脈瘤形成，其中少部分瘤壁有血栓形成，E、F、G組分別與B、C、D組相比，其動脈瘤高度和寬度均有不同程度減小(p值分別>0.05，<0.05，<0.05)，其中G組與F組相比，差異

15、無統(tǒng)計學意義(p>0.05)。(2)病理檢查結果顯示：E組動脈瘤壁平滑肌細胞減少且萎縮，降解明顯，瘤壁變薄，彈性纖維斷裂；F、G組動脈瘤血管壁平滑肌細胞辦有減少，但降解程度較輕，瘤壁稍變薄，彈性纖維輕度斷裂。(3)免疫組化檢測結果顯示：E、F、G組動脈瘤壁NF.rd3的表達分別與B、C、D組相比均有減少，p值分別>0.05，<0.05，<0.05，其中G組與F組相比，差異有統(tǒng)計學意義(p<0.05)；E、F、G組動脈瘤壁MCP-1的表達

16、分別與B、C、D組相比均有減少，p值分別>0.05，<0.05，<0.05，其中G組與F組相比，差異有統(tǒng)計學意義(p<0.05)。表明人工合成E-選擇素在應用2周后可明顯抑制NF-κB和MCP-1的表達。(4)Real-time PCR檢測結果顯示：E、F、G組動脈瘤壁NF-κB的表達分別與B、C、D組相比均有減少，p值分別>0.05，<0.05，<0.05，其中G組與F組相比，差異有統(tǒng)計學意義(p<0.05)；E、F、G組動脈瘤壁MC

17、P-1的表達分別與B、C、D組相比均有減少，p值分別>0.05，<0.05，<0.05，其中G組與F組相比，差異有統(tǒng)計學意義(p<0.05)。同樣表明人工合成E.選擇素在應用2周后可明顯抑制NF-κB和MCP-1的表達。
　　 結論：(1)人工合成E-選擇素可以延緩或抑制實驗性兔頸總動脈瘤瘤壁平滑肌細胞萎縮、減少以及彈性纖維斷裂，從而延緩或阻止動脈瘤的病理發(fā)展過程。(2)人工合成E-選擇素對實驗性兔頸總動脈瘤瘤壁NF-κB的激活