人工合成E-選擇素對兔頸總動脈瘤壁平滑肌細胞增殖活性的影響及機制探討.pdf

1、第一部分：實驗性免頸總動脈瘤模型的建立及模型動脈瘤壁平滑肌細胞的增殖變化
　　 研究背景及目的：蛛網(wǎng)膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage，SAH)是威脅生命的主要疾病之一，據(jù)統(tǒng)計，75％以上的蛛網(wǎng)膜下腔出血由顱內(nèi)動脈瘤(intracranial aneurysm，IA)破裂引起。目前，破裂動脈瘤僅限于外科手術夾閉和血管內(nèi)介入治療，且具有相當?shù)娘L險和一定的并發(fā)癥。因此，探討顱內(nèi)動脈瘤形成、發(fā)展和破裂的病理機制

2、，特別是對動脈瘤壁是否存在修復的可能性的探討具有重要意義。血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cells，VSMC)是平滑肌細胞層的重要組成部分。VSMC在正常的生理分化狀態(tài)下不表現(xiàn)增殖能力，但是當環(huán)境改變時VSMC可發(fā)生可逆的表型轉換，表現(xiàn)為喪失正常成熟細胞的生理功能并獲得增殖能力?？梢?，血管壁平滑肌細胞的生理功能改變是動脈瘤修復的基礎。動脈瘤形成過程是一個動脈破壞和修復的可逆過程，修復主要表現(xiàn)為中膜層平滑肌

3、細胞的增殖和遷移。我們用彈性蛋白酶(elastase，EA)滴注法成功誘導出實驗動物動脈瘤模型，該方法易重復，成本低，形態(tài)及病理特點更接近人體顱內(nèi)動脈瘤。我們擬通過對模型動脈瘤壁平滑肌細胞增殖活性的研究，探討顱內(nèi)動脈瘤壁的修復的可能性。
　　 方法：(1)新西蘭大白兔30只，雌雄各半，隨機分成4組，A組（對照組），B、C、D、E組為實驗組（其中B組為1周組，C組為2周組，D組為3周組，E組為4周組），每組6只，自由攝水和進食，室

4、溫20-25℃，獨籠飼養(yǎng)，術前禁水禁食12h。(2)游標卡尺測量距右頸內(nèi)外動脈分叉處近端約0.5cm～1.0cm頸總動脈(commoncarotidartery,CCA)直徑，手術顯微鏡下輕輕剝離該部表面的纖維結締組織，抽取50μ/ml的彈性蛋白酶0.2ml滴注其表面，對照組用PBS滴注，20min后通過兔耳緣靜脈緩慢推注肝素納500u。(3)1周后行兔頸總動脈系統(tǒng)CT血管造影(CTA)分別觀察對照組和實驗組兔右頸總動脈滴注部位血管的形

5、態(tài)改變和動脈瘤發(fā)展情況。(4)按照實驗動物分組，從手術日起每隔1周處死一組實驗動物，處死前測量動脈瘤的頸寬、瘤高，收集頸總動脈瘤標本（對照組于手術后1周取標本）。(5)對動脈瘤標本進行HE染色和光鏡檢查。(6)一部分標本進行免疫組化染色，對α-SMA、PCNA、MMP-2蛋白表達情況進行對比研究。(7)對另一部分標本進行實時熒光定量PCR(Real-timePCR)檢測OPNmRNA和MMP-2mRNA的表達變化。
　　 結果：

6、(1)影像學檢查結果：1周后兔頸總動脈系統(tǒng)CTA檢查發(fā)現(xiàn)。24只實驗兔均發(fā)現(xiàn)右側頸總動脈作用血管段形成明顯的梭形或囊狀動脈瘤，其中部分可見血栓形成，且有血管閉塞現(xiàn)象，對照組未發(fā)現(xiàn)動脈瘤樣病變；在兔處死前用游標卡尺測量動脈瘤的頸寬、瘤高。C組分別與B組相比，動脈瘤高度和寬度增大較明顯(p＜0.05)，而與D、E組比較，差異無統(tǒng)計學意義(p＞0.05)。(2)病理檢查結果顯示：兔頸總動脈瘤壁內(nèi)膜破壞并逐漸消失，彈性纖維斷裂，平滑肌細胞萎縮，

7、平滑肌細胞數(shù)目和層數(shù)減少。(3)免疫組化檢測結果顯示：MMP-2實驗組與對照組相比表達均有明顯增加(p＜0.05)；其中C組表達最高，與B、D、E組相比，差異顯著(p＜0.05)：而E組與D組比較，表達下降但差異不明顯(p＞0.05)。PCNA實驗組與對照組相比表達均有明顯增加(p＜0.05)；其中B組表達最高，與C、D、E組相比，差異顯著(p＜0.05)；而C、D、E組表達逐漸下降，但差異不明顯(p＞0.05)。α-SMA實驗組與對照

8、組相比表達均有明顯降低(P＞0.05)；其中B、C、D、E組表達逐漸下降，各組間差異均有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)。表明，α-SMA在對照組表達最高，實驗組表達逐漸降低；PCNA、MMP-2在對照組表達甚微，PCNA表達1周時最高，隨后逐漸下降，MMP-2在2周時表達最高。(4)Real-timePCR檢測結果顯示：：MMP-2實驗組與對照組相比表達均有明顯增加(p＜0.05)；其中C組表達最高，與B、D、E組相比，差異顯著(p＜0.0

9、5)；而D組與E組比較，差異無統(tǒng)計學意義(p＞0.05)。OPN實驗組與對照組相比表達均有明顯增加(p＜0.05)。對照組表達甚微，實驗組表達逐漸升高，B、C、D、E組各組間比較，差異均有統(tǒng)計學意義(p＞0.05)。
　　 結論：(1)彈性蛋白酶滴注誘導法建立的動脈瘤模型，方法簡便，易重復，成本低，且效果確切，模型較穩(wěn)定。此模型在動脈瘤形態(tài)、組織病理、形成發(fā)展機制上較接近人顱內(nèi)動脈瘤，既可用于病因和發(fā)病機制的研究，也可用于治療方

10、面的研究，是目前較為理想的動脈瘤模型之一。(2)平滑肌細胞數(shù)目和層數(shù)的減少在動脈瘤形成過程中起著關鍵作用，MMP-2分泌的增多是引起平滑肌層改變的重要原因。(3)動脈瘤形成過程中動脈瘤壁平滑肌細胞產(chǎn)生增殖，且VSMC由收縮型向合成型轉化以修復變形的動脈瘤壁。
　　 第二部分：人工合成E選擇素對兔頸總動脈瘤壁平滑肌細胞增殖活性的影響及機制探討
　　 研究背景及目的：顱內(nèi)動脈瘤破裂是引發(fā)蛛網(wǎng)膜下腔出血的主要原因，具有極高的致

11、死率和致殘率。目前，破裂動脈瘤僅限于外科手術夾閉和血管內(nèi)介入治療，對動脈瘤壁的修復研究甚少。但是隨著當今生物治療和基因治療的發(fā)展，對動脈瘤的藥物修復等非手術治療將擁有很大的發(fā)展前景。顱內(nèi)動脈分為內(nèi)皮層、平滑肌細胞層和外膜層，當發(fā)生動脈瘤時，內(nèi)皮層首先破壞，然后產(chǎn)生內(nèi)彈力層的斷裂和消失，接著是平滑肌細胞的退變與平滑細胞層數(shù)的減少，最后是外膜破壞與動脈瘤破裂。在整個動脈瘤形成過程中平滑肌細胞層的退變尤為顯著，而且是一個破壞與修復的可逆過程，

12、但由于血流切應力和炎癥的影響使得破壞的程度遠遠大于修復，最終導致動脈瘤破裂。因此，探討顱內(nèi)動脈瘤形成過程中平滑肌細胞的增殖活性，將成為動脈瘤壁修復研究的基礎。本部分在第一部分利用彈性蛋白酶滴注法誘導實驗性兔頸內(nèi)動脈動脈瘤模型的基礎上，應用人工合成E選擇素進行干預，以觀察炎癥和動脈瘤壁平滑肌細胞增殖活性的關系，為顱內(nèi)動脈瘤壁的修復研究提供依據(jù)。
　　 方法：(1)新西蘭大白兔24只作為治療組，雌雄各半，隨機分成4組，分別為F、G、

13、H、I組（其中F組為1周組，G組為2周組，H組為3周組，I組為4周組），每組6只，自由進水和攝食，室溫20～25℃，獨籠飼養(yǎng)，術前禁水禁食12h。(2)與第一部分相同，建立實驗性兔頸總動脈瘤模型。(3)將各組兔右側耳緣靜脈埋置24GY型靜脈留置針，沿兔耳緣靜脈注射人工合成E-選擇素2mg/(kg·w)，分別至第1、2、3、4周末處死。(4)1周后行兔頸總動脈系統(tǒng)CTA分別觀察治療組組兔右側頸總動脈滴注局部血管的形態(tài)改變和動脈瘤發(fā)展情況。

14、(5)按照實驗動物分組，從手術日起每隔1周處死一組實驗動物，處死前測量動脈瘤的頸寬、瘤高，收集頸內(nèi)動脈瘤標本。(6)對標本進行HE染色和光鏡檢查。(7)對標本進行免疫組化染色，對α-SMA、PCNA和MMP-2蛋白表達情況進行研究。(8)對標本進行進行實時熒光定量PCR（Real-timePCR）檢測OPNmRNA和MMP-2mRNA表達情況。
　　 結果：(1)影像學檢查和大體測量結果顯示：1周后兔頸內(nèi)動脈系統(tǒng)CTA檢查發(fā)現(xiàn)，

15、24只治療組兔右頸總動脈作用血管段均發(fā)現(xiàn)有梭形或囊狀動脈瘤形成，其中少部分瘤壁有血栓形成，G、H、I組分別與C、D、E組相比，其動脈瘤高度和寬度均有明顯減小(p＜0.05)，而F組與B組相比，動脈瘤高度和寬度減小不明顯(p＞0.05)。(2)病理檢查結果顯示：治療組動脈瘤壁與實驗組相比，平滑肌細胞數(shù)目和層數(shù)減少的程度明顯下降，彈性纖維斷裂和平滑肌細胞降解的程度亦有減輕。(3)MMP-2治療組與實驗組相比表達均有不同程度減少；其中F組與B

16、組、G組與C組相比，差異具有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)；其余兩時間段兩組比較，差異不明顯(p＞0.05)。PCNAF組與B組、G組與C組相比，表達明顯減少(p＜0.05)；而H組和D組相比，表達升高且有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)；I組和E組相比，表達升高但不明顯(p＞0.05)。α-SMA治療組與實驗組相比表達均有不同程度減少；其中E組與I組相比，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)；其余各時間段兩組比較，差異明顯(p＜0.05)。(4)P

17、CR檢測結果顯示：OPN治療組與實驗組相比表達均有不同程度升高；其中E組與I組相比，差異無統(tǒng)計學意義(p＞0.05)；其余各時間段兩組比較，差異明顯(p＜0.05)。MMP-2治療組與實驗組相比表達均有不同程度減少：其中F組與B組、G組與C組相比，差異具有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)；其余時間段兩組比較，差異不明顯(p＞0.05)。
　　 結論：(1)人工合成E-選擇素可以抑制兔頸總動脈瘤壁平滑肌細胞數(shù)目和層數(shù)的減少，減輕彈性纖維