擬南芥AtCPK30基因的表達模式和功能分析.pdf

1、鈣是真核生物信號轉(zhuǎn)導中普遍存在的第二信使。植物中各種各樣的信號都調(diào)節(jié)細胞內(nèi)鈣離子的水平，如激素、光、協(xié)迫等。關(guān)于鈣離子介導的信號是如何特異地傳遞是一個重要的生物學問題，目前研究表明，似乎是不同的刺激引起不同的鈣識別物，而鈣信號中的傳遞因子能夠識別這些特異的鈣識別物，并將這種信號傳遞到下游從而發(fā)揮作用，包括改變蛋白的磷酸化作用和基因的表達模式。 鈣依賴蛋白激酶（CDPKs）廣泛存在于植物體內(nèi)，目前發(fā)現(xiàn)，大多的鈣信號傳遞都與鈣依賴蛋

2、白激酶有關(guān)。作為鈣信號途徑中一個傳遞因子，它參與了包括激素信號轉(zhuǎn)導途徑在內(nèi)的很多傳遞過程。本工作在前人研究的基礎(chǔ)上，對擬南芥的一個鈣依賴蛋白激酶基因（AtCPK30）進行了深入的研究。具體研究結(jié)果如下： 為了便于實驗中T-DNA插入突變體的篩選，首先制作了一種簡易可行的擬南芥水培裝置。這套裝置主要由兩部分組成：播放種子的塑料管和作為支撐物的不銹鋼絲網(wǎng)，盛溶液的容器。實驗表明：T-DNA插入突變體在這種水培裝置中生長良好，且培養(yǎng)的

3、費用低，易于管理等。由于有鋼絲網(wǎng)作支撐，植株能夠順利完成整個生長周期并且結(jié)實飽滿，種子萌發(fā)率高。并采用“雙引物法”篩選到了多個T-DNA插入突變體純合子，為進行下一步實驗做好準備。 接下來進行了AtCPK30基因的表達模式研究。收集野生型擬南芥根、莖、葉、花、果，通用半定量RT-PCR分析組織表達特異性。結(jié)果表明：AtCPK30在植物根中有很高的表達量，而在其它組織表達較低。將生長三周的野生型幼苗分別用植物激素脫落酸(ABA)、

4、吲哚乙酸(IAA)、2,4-二氯苯氧乙苯酸(2,4-D)、赤霉素(GA3)和6-芐氨基嘌呤(BA)處理，然后采用半定量RT-PCR(逆轉(zhuǎn)錄PCR)分析AtCPK30基因在幼苗中的轉(zhuǎn)錄水平的變化情況。實驗發(fā)現(xiàn)AtCPK30基因的表達受ABA、IAA、2,4-D、GA3和BA等激素的誘導。 又通過基因克隆構(gòu)建了AtCPK30基因的植物超表達載體。并將此質(zhì)粒利用基因槍法轉(zhuǎn)入洋蔥表皮細胞中，進行瞬時表達實驗，了解AtCPK30基因的亞細

5、胞定位情況。結(jié)果證明AtCPK30蛋白定位在細胞壁和細胞膜上。 同時將超表達載體通過浸花蕾法轉(zhuǎn)入野生型擬南芥中，得到了AtCPK30基因超表達的轉(zhuǎn)基因株系純合子。測量在同一MS培養(yǎng)基上生長的野生型和轉(zhuǎn)基因植株幼苗主根長，結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因植株主根在幼苗生長前期比野生型的長，但在第11天時，這種差異不明顯。同時發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株幼苗的根在缺鈣的MS培養(yǎng)基上長勢較野生型植株好，表明缺鈣對轉(zhuǎn)基因幼苗影響較小。以野生型為對照，用植物激素ABA和