雄黃對大鼠神經(jīng)行為、海馬突觸間隙Glu水平及其受體NMDA水平的影響.pdf

1、雄黃(Realgar)是一味在中藥復方中出現(xiàn)頻率較高的礦物性中藥，現(xiàn)行四大中國國家標準收載全部中藥制劑中，含雄黃的制劑多達2.80％(194/6938)，同時也是中國國務院在《醫(yī)療用藥毒性藥品管理辦法》中特別規(guī)定的28種毒性中藥之一。臨床上由于受傳統(tǒng)用藥習慣（“中藥沒有不良反應”或“中藥無毒副作用”）的影響，而未科學（長期、超量和不規(guī)范）合理使用單味雄黃或其復方制劑引起不良反應或慢性砷中毒事件時有報道，其中不少是新生兒、少兒濫用所致。由

2、此引發(fā)的雄黃對人體（尤其少年兒童）健康的影響，已成為人們關注的焦點。雄黃主要成分為二硫化二砷(As2S2)或四硫化四砷(As4S4)，另含有少量As2O3[iAs(Ⅲ)，即砒霜]和As2O5[iAs(V)]。無機砷在體內(nèi)經(jīng)過氧化甲基化和還原，可產(chǎn)生多種甲基化代謝產(chǎn)物，隨血液分布到全身各組織器官或系統(tǒng)，造成機體損傷。流行病學調(diào)查顯示長期暴露砷的兒童注意力、語言能力和長期記憶力均下降。動物實驗表明，砷是一種發(fā)育毒物，可通過血腦屏障進入腦組織

3、并蓄積，導致實驗動物的智力和認知能力等學習和記憶方面的障礙。目前，雄黃暴露對中樞神經(jīng)系統(tǒng)學習記憶能力損害的分子機理尚不十分清楚。因此，本研究通過Moms水迷宮、新事物識別實驗、礦場試驗，探討中藥雄黃對大鼠神經(jīng)行為的影響，觀察海馬超微結(jié)構(gòu)，海馬細胞內(nèi)鈣離子、海馬突觸間隙Glu含量的變化及NMDA受體亞基mRNA和蛋白的表達，為雄黃對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的毒性機制研究提供理論依據(jù)。
　　 材料與方法
　　 清潔級健康Wistar大鼠

4、80只（中國醫(yī)科大學實驗動物中心提供，許可證號:SCXK（遼）2003-0009），雌雄各半，體重60～80 g。飼養(yǎng)環(huán)境條件:室溫設在24±1℃，相對濕度保持在（50±5）％，室內(nèi)人工照明(12小時光/暗循環(huán)，光照時間6:00-18:00)，大鼠自由攝食及飲水。按照體重分層隨機分為4個雄黃灌胃劑量組(0、0.3、0.9、2.7 g/kg， n=20)，雄黃溶解于5‰羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)成混懸液。灌胃一日一次，連續(xù)染毒6周，每

5、周七天，每三天稱量體重1次，每天觀察動物的中毒癥狀。于末次給藥2小時后，10％水合氯醛(0.4ml/100g)腹腔注射麻醉，斷頭，冰浴取大腦，分離海馬并立即轉(zhuǎn)入到液態(tài)氮中，然后將其存儲在-80℃。
　　 第一部分實驗:采用Morris水迷宮、新事物識別實驗、曠場試驗，探討中藥雄黃對大鼠神經(jīng)行為學的影響。
　　 第二部分實驗:采用冷阱捕集-氫化物發(fā)生-原子吸收法測定雄黃染毒6周大鼠腦組織形態(tài)砷的含量;微透析-高效液相聯(lián)用檢

6、測海馬突觸間隙Glu含量的變化。
　　 第三部分實驗:采用Real-timePCR和Western blot檢測NMDA受體亞基mRNA和蛋白的表達;流式細胞儀檢測海馬細胞內(nèi)鈣離子;電鏡觀察海馬超微結(jié)構(gòu)的變化。
　　 結(jié)果
　　 實驗表明，在水迷宮實驗中，各組大鼠經(jīng)過訓練學習，均可對水下逃逸平臺產(chǎn)生空間定位記憶，與對照組比較，各染毒組都表現(xiàn)出尋找平臺的潛伏期延長的現(xiàn)象，但沒有統(tǒng)計學意義。實驗過程中大鼠有目的游動，

7、能有重點的搜索平臺表明大鼠存在著記憶能力，在給予大鼠的雄黃劑量增加時，與對照組比較，高劑量組的穿越平臺次數(shù)的顯著減少;新事物識別實驗中，對照組相比，中、高劑量組大鼠的識別能力明顯降低;在曠場試驗中，高劑量組大鼠在中央活動的時間顯著增加，表明雄黃可以引起大鼠的學習記憶功能發(fā)生障礙。
　　 在大鼠腦組織中檢測到MMA和DMA，未檢測到iAs。雄黃灌胃6周后，與對照組比較，各劑量組大鼠腦組織中MMA、DMA含量水平均顯著增加(P＜0.

8、05)。實驗結(jié)果提示雄黃代謝產(chǎn)物MMA和DMA可通過血腦屏障在腦組織中蓄積，并且腦中MMA、DMA和TAs的量隨著雄黃染毒劑量的增加而升高，成功的建立了雄黃暴露大鼠模型，提示長期雄黃暴露下，雄黃中砷可以進入腦組織并蓄積，從而發(fā)揮其神經(jīng)毒性。
　　 與對照組相比，染毒組海馬突觸間隙Glu含量明顯升高，并且隨著雄黃染毒劑量的增加而增加，提示雄黃可以導致Glu蓄積從而產(chǎn)生興奮性毒性。
　　 雄黃暴露6周后，與對照組比較，高劑量

9、組大鼠NR2A亞基的基因和蛋白表達都明顯升高，而NR1和NR2B亞基表達沒有改變。那么，NR2A亞基表達升高很可能是介導雄黃致大鼠學習記憶障礙的分子機制之一。
　　 在我們的雄黃中毒的大鼠模型中，與對照組相比，中，高劑量組大鼠海馬細胞中Ca2+明顯升高。Ca2+的超載，可能引起細胞內(nèi)Ca2+自穩(wěn)態(tài)紊亂，進而線粒體能量代謝障礙，誘導神經(jīng)細胞凋亡。
　　 海馬超微結(jié)構(gòu)的觀察發(fā)現(xiàn)雄黃暴露大鼠的海馬神經(jīng)元細胞中的線粒體多為嵴減少

10、或空泡化、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴大以及高爾基復合體擴張，這樣三個關鍵細胞器的病理變化會影響細胞的代謝活動。
　　 結(jié)論：
　　 1、雄黃暴露可以導致大鼠空間學習記憶能力下降，新事物識別能力的降低，以及曠場認知能力的損傷。
　　 2、雄黃在大鼠體內(nèi)代謝的甲基化產(chǎn)物MMA和DMA可以通過血腦屏障進入并蓄積腦中，并且腦中MMA和DMA的量隨著雄黃染毒劑量的增加而升高。
　　 3、雄黃暴露導致大鼠海馬組織中突觸間隙Glu含