自體富血小板血漿對(duì)膝關(guān)節(jié)退行性變和難愈性創(chuàng)面治療作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:本研究應(yīng)用兩步離心法制備PRP，通過分析PRP中血小板、白細(xì)胞和生長因子的濃度，計(jì)算回收率和富集系數(shù)，并做相關(guān)性分析，探討PRP制備方法的實(shí)用性和穩(wěn)定性。
　　關(guān)節(jié)退變臨床產(chǎn)生關(guān)節(jié)疼痛，活動(dòng)受限和關(guān)節(jié)畸形等癥狀，是導(dǎo)致患者長期痛苦和身體殘疾的常見原因，不僅極大地影響了人們的生活質(zhì)量，導(dǎo)致人力資源的喪失，也給家庭和社會(huì)帶來沉重負(fù)擔(dān)。傳統(tǒng)方法存在諸多弊端和生物學(xué)技術(shù)不斷取得新進(jìn)展的今天，PRP技術(shù)為我們治療骨性關(guān)節(jié)炎提供了一種嶄

2、新的治療思路和方法。通過關(guān)節(jié)內(nèi)注射的方法，將PRP與玻璃酸鈉作比較，探討關(guān)節(jié)內(nèi)注射PRP治療關(guān)節(jié)軟骨退行性變的安全性和療效。
　　慢性難愈性創(chuàng)面的治療一直是醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)，傳統(tǒng)的傷口換藥、清創(chuàng)手術(shù)、負(fù)壓真空吸引和局部應(yīng)用各種藥物等治療，能清除局部感染灶或壞死組織，減少潰瘍分泌物，但仍有許多創(chuàng)面難以愈合，我們采用局部噴灑PRP的方法治療慢性難愈性創(chuàng)面，探索PRP治療慢性難愈性創(chuàng)面的安全性和療效，同時(shí)通過體外實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)其抗感染作用。

3、r>　　方法:取30例成年健康自愿者捐獻(xiàn)的外周血，男女各15例;年齡24～76歲，平均47歲。用預(yù)先裝有5 mL枸櫞酸鈉注射液的50 mL一次性注射器以18 G針頭于每例志愿者肘前靜脈取血40 mL。搖勻后，取1 mL作血細(xì)胞分析，4 mL作生長因子濃度測(cè)定;剩余40 mL注入PRP制備套裝離心管中，于嚴(yán)格無菌狀態(tài)下制備PRP。根據(jù)血液中各組分的沉降系數(shù)不同，以離心半徑15 cm、2000 r/min離心10 min后，全血分為3層，上

4、層為上清液，下層為紅細(xì)胞，兩層交界處一淺黃色層即PRP層。分別將1 mL抗凝靜脈血和制備的PRP采用全自動(dòng)血液分析儀進(jìn)行血常規(guī)分析，測(cè)定血小板及白細(xì)胞濃度，并計(jì)算PRP中血小板和白細(xì)胞濃度變異系數(shù)。計(jì)算PRP中血小板或白細(xì)胞回收率和富集系數(shù)，回收率=PRP中血小板或白細(xì)胞總數(shù)/全血中血小板或白細(xì)胞總數(shù)×100％，富集系數(shù)=PRP中血小板或白細(xì)胞濃度/全血中血小板或白細(xì)胞濃度。分別測(cè)定男、女自愿者PRP血小板及白細(xì)胞濃度。生長因子濃度測(cè)定

5、于4 mL抗凝靜脈血中加入0.4 mL凝血酶和氯化鈣混合物(2000 U凝血酶中加入5 mL5％氯化鈣溶液)，3 min后血液凝聚成凍膠狀，常溫下靜置1h后，同上法離心10 min，吸取上清液轉(zhuǎn)移到凍存管中。將制備的PRP采用相同方法制備得到富含生長因子的上清液。取制備的全血及PRP上清液，按照ELISA試劑盒說明測(cè)定PDGF、TGF-β及VEGF濃度。
　　將30例慢性關(guān)節(jié)疼痛或腫脹（不得少于4月），X或MRI有退行性變表現(xiàn)的膝

6、關(guān)節(jié)軟骨退行性變患者納入研究。根據(jù)患者的年齡、性別、體重指數(shù)以及Kellgren&Lawrence骨性關(guān)節(jié)炎分級(jí)情況將30例病人分配到PRP組（試驗(yàn)組）和透明質(zhì)酸鈉(Sodium hyaluronate，SH)。試驗(yàn)組15例患者（15膝），每次關(guān)節(jié)內(nèi)注射3.5mLPRP，對(duì)照組15例患者（15膝），每次關(guān)節(jié)內(nèi)注射透明質(zhì)酸鈉(Sodiumhyaluronate，SH)2 mL。所有患者每3周注射一次，連續(xù)3次為一個(gè)療程。通過記錄治療過程中

7、相關(guān)不良事件的數(shù)量、發(fā)生時(shí)間、嚴(yán)重程度、持續(xù)時(shí)間和處理結(jié)果來評(píng)估該治療方法的安全性。通過比較注射前和3、4、6月隨訪時(shí)的國際膝部文件委員會(huì)(IKDC)主觀膝部評(píng)估表、WOMAC評(píng)價(jià)表、Lequesne指數(shù)評(píng)估表來評(píng)估其臨床療效。
　　將符合選擇標(biāo)準(zhǔn)的21例慢性難愈性創(chuàng)面患者納入本項(xiàng)研究。男8例，女13例;年齡48～78歲，平均58.5歲。開放原始創(chuàng)面，徹底清創(chuàng)，按照1∶10的比例將制備的2～8mL自體PRP與促凝劑（2000U凝血

8、酶中加入5mL5％氯化鈣溶液）同時(shí)緩慢噴灑入創(chuàng)面并盡量覆蓋所有創(chuàng)面。3min后創(chuàng)面表面形成一層PRP凝膠，取大小合適的無菌透明薄膜覆蓋于創(chuàng)口，四周密封確保PRP不流失，術(shù)后1周內(nèi)建議患者盡量減少創(chuàng)面臨近關(guān)節(jié)的活動(dòng)量。術(shù)后可視情況更換無菌敷料，一般1周左右查看創(chuàng)面。囑患者避免用手碰觸患處，根據(jù)創(chuàng)面情況決定PRP使用的次數(shù)。采用滴注無菌生理鹽水的方法測(cè)定傷口體積和計(jì)算創(chuàng)面覆蓋率，我們將3個(gè)月內(nèi)的創(chuàng)面愈合情況分為如下五個(gè)等級(jí):Ⅰ級(jí)完全愈合，覆

9、蓋率100％;Ⅱ級(jí)明顯愈合，覆蓋率在75％-100％之間;Ⅲ級(jí)有效愈合，覆蓋率在50％-75％之間;Ⅳ級(jí)部分有效愈合，覆蓋率在25％-50％之間;Ⅴ級(jí)無效愈合，覆蓋率低于25％。對(duì)于3個(gè)月后沒有痊愈的患者，在征求他們同意的情況下給予再次PRP治療或繼續(xù)觀察治療。于治療前及3月隨訪結(jié)束時(shí)分別行創(chuàng)面內(nèi)分泌物細(xì)菌培養(yǎng)，對(duì)比觀察。選取創(chuàng)面感染最常見的金黃色葡萄球菌作為實(shí)驗(yàn)菌株，分別在PRP凝膠及PRP等培養(yǎng)基中孵育，分別于2、4、6、8、12、

10、24h取樣計(jì)數(shù)菌落數(shù)，繪制時(shí)間-抑菌曲線圖，計(jì)算細(xì)菌減少率。
　　結(jié)果:研究發(fā)現(xiàn)全血和PRP中血小板濃度分別為(131.40±29.44)×109/L和(819.47±136.32)×109/L，比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-27.020，P=0.000）;PRP中血小板回收率為60.85％±8.97％，富集系數(shù)為6.40±1.06。全血和PRP中白細(xì)胞濃度分別為(5.57±1.91)×1012/L和(32.20±10.42)×10

11、12/L，比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-13.780，P=0.000）;PRP中白細(xì)胞回收率為58.30％±19.24％，富集系數(shù)為6.10±1.93。PRP中血小板濃度和白細(xì)胞濃度分別與全血中血小板濃度(r=0.652,P=0.000)和白細(xì)胞濃度(r=0.460，P=0.011)成正相關(guān)。男性組和女性組PRP中血小板濃度和白細(xì)胞濃度比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。PRP中PDGF、TGF-β、VEGF濃度分別為(698.15±

12、64.48)、(681.36±65.90)、(1071.55±106.04) ng/mL，是全血的(5.67±1.18)、(6.99±0.61)、(5.74±0.83)倍。PRP中PDGF濃度(r=0.832,P=0.020)、TGF-β濃度(r=0.835,P=0.019)、VEGF濃度(r=0.824,P=0.023)均與PRP中血小板濃度成正相關(guān)。
　　在關(guān)節(jié)軟骨退變部分的臨床研究中未發(fā)生關(guān)節(jié)內(nèi)感染、肌肉萎縮、深靜脈血栓、發(fā)

13、熱、血腫和異常組織增生等不良反應(yīng)，與對(duì)照組相比試驗(yàn)組未表現(xiàn)出有更長的不良反應(yīng)持續(xù)時(shí)間(P=0.862)，所有出現(xiàn)不良反應(yīng)的患者在得到合理治療后都在4天內(nèi)恢復(fù)到治療前狀態(tài)。試驗(yàn)組患者的評(píng)分在6個(gè)月內(nèi)保持了穩(wěn)定，而對(duì)照組只在前4個(gè)月內(nèi)保持了穩(wěn)定，在第6個(gè)月隨訪時(shí)就表現(xiàn)出明顯的減低(PIKDC=0.003,PWOWAC=0.048,PLequesne=0.002)。在前4個(gè)月內(nèi)試驗(yàn)組患者的狀態(tài)改善并不優(yōu)于對(duì)照組(P＞0.05)，但在隨訪到6月

14、時(shí)IKDC評(píng)分和Lequesne指數(shù)的改變提示此時(shí)試驗(yàn)組患者膝關(guān)節(jié)狀態(tài)優(yōu)于對(duì)照組(PIKDC=0.000，PLequesne=0.013)。短期結(jié)果證實(shí)關(guān)節(jié)內(nèi)注射PRP治療關(guān)節(jié)軟骨退行性病變是安全的，其長期療效可能會(huì)優(yōu)于透明質(zhì)酸鈉。
　　在難愈性創(chuàng)面的研究中未發(fā)生創(chuàng)面感染加重、菌血癥、局部異常組織增生等不良反應(yīng)。治療后第1、2、4周隨訪時(shí)創(chuàng)面覆蓋率分別為(55.1±22.6)％、(72.0±16.2)％，(84.3±14.0)％，

15、周間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，說明在治療的4周內(nèi)，創(chuàng)面處于持續(xù)修復(fù)狀態(tài)。3個(gè)月隨訪時(shí)，創(chuàng)面體積為(1.5±1.8) mL，創(chuàng)面平均覆蓋率為85.6％，治愈率為57.1％，治療的有效率和患者主觀滿意率均為95.23％。體外抑菌結(jié)果顯示PRP凝膠抗菌作用明顯，細(xì)菌數(shù)量于孵育4h時(shí)降至最低。
　　結(jié)論:結(jié)合二次離心法使用PRP制備套裝可以穩(wěn)定地制備出富含高濃度血小板、白細(xì)胞和生長因子的PRP。關(guān)節(jié)內(nèi)注射PRP為臨床治療膝關(guān)節(jié)退行

16、性變提供了一種可能的選擇，但是需要大樣本的隨機(jī)對(duì)照研究的長期隨訪結(jié)果以進(jìn)一步證實(shí)其安全性和療效。PRP不但能有效安全的促進(jìn)慢性難愈性創(chuàng)面的愈合，并有潛在的抗感染作用。
　　意義:通過對(duì)PRP細(xì)胞成分的檢測(cè)、抗菌活性的測(cè)定等多個(gè)層面的研究，確定了制備PRP的最佳離心時(shí)間及離心力，為PRP在骨科的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)和現(xiàn)實(shí)指導(dǎo)。利用自體PRP來解決關(guān)節(jié)軟骨損傷和難愈性創(chuàng)面修復(fù)的難題，無免疫排斥反應(yīng)，制備簡(jiǎn)便，費(fèi)用低廉，能有效地縮短治療