清香散對(duì)炎癥性腸病大鼠模型急性期療效及機(jī)理研究.pdf

1、研究背景 炎癥性腸病(IBD)為消化系疾病中研究的重點(diǎn)與難點(diǎn)，因其病因不明，且在我國(guó)發(fā)病呈逐年上升之趨勢(shì)，所以治療十分棘手。目前國(guó)內(nèi)治療該病側(cè)重于中西醫(yī)結(jié)合為主。在中醫(yī)藥關(guān)于炎癥性腸病的認(rèn)識(shí)中，大多數(shù)學(xué)者認(rèn)同以急性期與緩解期，分而治之，急性期以清熱利濕為主，屬于濕熱病證范疇。緩解期以健脾利濕為主。清香散為導(dǎo)師吳仕九教授多年從事濕熱證基礎(chǔ)與臨床研究的經(jīng)驗(yàn)方，功效清熱利濕，健脾和胃。 目的與意義 本實(shí)驗(yàn)研究利用三硝基

2、苯磺酸鈉(TNBS)法制作的炎癥性腸病大鼠模型，從以下幾個(gè)方面進(jìn)行探求：1、清香散對(duì)炎癥性腸病的治療作用，對(duì)TNBS大鼠一般癥狀如體重、腹瀉及便血狀況、髓過(guò)氧化物酶活力(MPO)、腸道粘膜損害及組織病理?yè)p害的影響；2、研究清香散對(duì)TNBS大鼠結(jié)腸組織超氧化物歧化酶活力(SOD)與丙二醛(MDA)含量影響，探討其治療炎癥性腸病的機(jī)理之一；3、研究清香散對(duì)TNBS大鼠腸組織一氧化氮(NO)含量與一氧化氮合酶(NOS)活力的影響，探討其治療炎

3、癥性腸病的機(jī)理之二；4、研究清香散對(duì)TNBS大鼠腸組織細(xì)胞因子白介素1β(IL-1β)及腫瘤壞死因子(TNF-α)的影響，從炎癥介質(zhì)角度探討其治療炎癥性腸病機(jī)理之三；5、研究清香散對(duì)TNBS大鼠腸組織細(xì)胞核中核因子kappB(NF-κB)活性影響，探討其治療炎癥性腸病機(jī)制之四；從上述多角度進(jìn)行炎癥性腸病的療效及機(jī)理研究，目的是為臨床治療該病，提高治療效果打下較為扎實(shí)的基礎(chǔ)。 材料與方法 1、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組：將60只220g

4、-250gSD大鼠隨機(jī)分為T(mén)NBS模型對(duì)照組、清香散低劑量組、中劑量組、高劑量組、柳氮橫胺吡啶組(SASP)及乙醇對(duì)照組6組，每組各10只。其中乙醇對(duì)照組為正常對(duì)照。大鼠禁食24h后，20％烏拉坦(0.5ml/只)腹腔注射麻醉后，外徑1.8mm橡膠管插入結(jié)腸，至距肛門(mén)約8cm處，將預(yù)混的120mg/kg5％TNBS和0.25ml的50％乙醇溶液注入結(jié)腸，乙醇組給予0.25ml的50％乙醇溶液，夾閉肛門(mén)，大鼠頭低位30min，自由食水，造

5、模后24h開(kāi)始給藥。 結(jié)果 1、清香散對(duì)TNBS致結(jié)腸炎模型大鼠體重的影響 2、清香散對(duì)TNBS致結(jié)腸炎模型大鼠疾病活動(dòng)指數(shù)(diseaseactivityindex，DAI)影響：腹瀉及便血是炎癥性腸病常見(jiàn)的癥狀，而疾病活動(dòng)指數(shù)則是用來(lái)評(píng)估實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的腹瀉及便血情況。造模術(shù)后第7天時(shí)，清香散低、中、高劑量組及柳氮磺胺吡啶組的DAI值均低于TNBS模型對(duì)照組(P＜0.01)，而高于乙醇對(duì)照組(P＜0.01)。TNB

6、S模型對(duì)照組的DAI值高于乙醇對(duì)照組(P＜0.01)。以上結(jié)果表明清香散能改善TNBS模型大鼠的腹瀉與便血癥狀。 3、清香散對(duì)TNBS致結(jié)腸炎模型大鼠結(jié)腸粘膜損害的影響 TNBS法IBD大鼠模型的機(jī)理首先為乙醇破壞了腸粘膜，然后TNBS作為半抗原與大分子結(jié)合，引起繼發(fā)免疫損傷。因此觀察結(jié)腸粘膜損害可以從大體上評(píng)價(jià)炎癥的輕重程度。 4、清香散對(duì)TNBS致結(jié)腸炎模型大鼠結(jié)腸組織病理改變的影響 結(jié)腸組織病理學(xué)改

7、變是評(píng)價(jià)藥物作用療效的最有力的證據(jù)之一。對(duì)造模術(shù)后第7天時(shí)各組大鼠結(jié)腸組織HE染色標(biāo)本進(jìn)行評(píng)分。清香散各劑量組及柳氮磺胺吡啶組的組織病理?yè)p害評(píng)分均高于乙醇對(duì)照組(P＜0.01)，低于TNBS模型對(duì)照組(P＜0.01)，乙醇對(duì)照組的病理?yè)p害評(píng)分低于TNBS模型對(duì)照組(P＜0.01)，以上結(jié)果表明清香散能減輕TNBS模型大鼠結(jié)腸組織病理?yè)p害。 5、清香散對(duì)TNBS致結(jié)腸炎模型大鼠髓過(guò)氧化物酶(MPO)的影響 MPO是中性粒細(xì)

8、胞中含量較高的一種酶，其含量的增加可以反映中性粒細(xì)胞在某一組織中的增加，間接反映炎癥在組織中的存在，因此MPO常用作為評(píng)價(jià)急性炎癥程度的一種生化標(biāo)志。 6、清香散對(duì)TNBS致結(jié)腸炎模型大鼠結(jié)腸一氧化氮(NO)與一氧化氮合酶(NOS)的影響：生理劑量的NOS及其誘導(dǎo)生成的NO對(duì)機(jī)體有保護(hù)作用，而在炎癥性腸病時(shí)，腸粘膜中NOS活力增加致NO過(guò)度生成，從而造成粘膜的損傷。而降低腸粘膜中NOS及其誘導(dǎo)生成的NO則能減輕腸粘膜的損傷。

9、 6.1清香散對(duì)TNBS致結(jié)腸炎模型大鼠結(jié)腸一氧化氮(NO)影響：對(duì)各組大鼠造模術(shù)后第7天時(shí)結(jié)腸組織中NO含量檢測(cè)，TNBS模型對(duì)照組、清香散各劑量組與柳氮磺胺吡啶組NO值高于乙醇對(duì)照組(P＜0.001)，而清香散各劑量組與柳氮磺胺吡啶組NO值低于TNBS模型對(duì)照組(P＜0.001)。以上結(jié)果表明清香散能減少TNBS模型大鼠腸組織NO含量。 6.2清香散對(duì)TNBS致結(jié)腸炎模型大鼠結(jié)腸一氧化氮合酶(NOS)影響：對(duì)各組大鼠造模

10、術(shù)后第7天時(shí)結(jié)腸組織中NOS活力檢測(cè)，TNBS模型對(duì)照組及清香散各劑量組與柳氮磺胺吡啶組NOS活力高于乙醇對(duì)照組(P＜0.001)。而清香散各劑量組與柳氮磺胺吡啶組NOS活力低于TNBS模型對(duì)照組(P＜0.001)。以上結(jié)果表明清香散能減少TNBS模型大鼠腸組織NOS活力。 從清香散各劑量組對(duì)TNBS模型大鼠結(jié)腸組織NOS與NO影響結(jié)果來(lái)看，清香散各劑量組能減少TNBS模型大鼠腸道組織中NOS活力以及其誘導(dǎo)過(guò)度生成的NO，對(duì)結(jié)腸

11、粘膜具有保護(hù)作用。 7、清香散對(duì)TNBS致結(jié)腸炎模型大鼠腸組織活性氧及自由基清除能力影響：活性氧與自由基在炎癥性腸病的發(fā)病中具有重要意義，提高機(jī)體活性氧及自由基清除能力能減輕炎癥。 7.1清香散對(duì)TNBS致結(jié)腸炎模型大鼠結(jié)腸組織超氧化物歧化酶(SOD)影響：體內(nèi)SOD能清除活性氧與自由基。對(duì)各組大鼠造模術(shù)后第7天時(shí)結(jié)腸組織中SOD活力檢測(cè)，TNBS模型對(duì)照組及清香散各劑量組與柳氮磺胺吡啶組SOD活力低于乙醇對(duì)照組(P＜0

12、.001)。 7.2清香散對(duì)TNBS致結(jié)腸炎模型大鼠腸組織丙二醛(MDA)影響：MDA為自由基損傷組織后的產(chǎn)物。對(duì)各組大鼠造模術(shù)后第7天時(shí)結(jié)腸組織中MDA含量檢測(cè)，TNBS模型對(duì)照組及清香散各劑量組與柳氮磺胺吡啶組MDA含量高于乙醇對(duì)照組(P＜0.001)。而清香散各劑量組與柳氮磺胺吡啶組MDA含量低于TNBS模型對(duì)照組(P＜0.001)。以上結(jié)果表明清香散能降低TNBS模型大鼠腸組織MDA含量，提示清香散能減輕活性氧與自由基對(duì)

13、組織的損傷。 8、清香散對(duì)TNBS致結(jié)腸炎模型大鼠腸組織中炎性介質(zhì)mRNA如腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白介素1β(IL-1β)表達(dá)影響：TNF-α與IL-1β在炎癥性腸病的發(fā)病中起重要作用，目前有針對(duì)TNF-α單克隆抗體及IL-1受體分別用于炎癥性腸病的臨床，取得較好的效果，研究表明，炎癥性腸病急性期TNF-α與IL-1β表達(dá)減少，炎癥亦減輕。 8.1清香散對(duì)TNBS致結(jié)腸炎模型大鼠腸組織中TNF-αmRNA表達(dá)影響

14、：對(duì)各組大鼠造模術(shù)后第7天時(shí)結(jié)腸組織中TNF-αmRNA表達(dá)檢測(cè)，TNBS模型對(duì)照組及清香散各劑量組與柳氮磺胺吡啶組TNF-αmRNA表達(dá)量高于乙醇對(duì)照組(P＜0.001)。而清香散各劑量組與柳氮磺胺吡啶組TNF-αmRNA表達(dá)量低于TNBS模型對(duì)照組(P≤0.002)。以上結(jié)果表明清香散能下調(diào)TNBS模型大鼠腸組織TNF-αmRNA表達(dá)。 8.2清香散對(duì)TNBS致結(jié)腸炎模型大鼠腸組織中IL-1βmRNA表達(dá)影響：對(duì)各組大鼠造模

15、術(shù)后第7天時(shí)結(jié)腸組織中IL-1βmRNA表達(dá)檢測(cè)，TNBS模型對(duì)照組及清香散各劑量組與柳氮磺胺吡啶組IL-1βmRNA表達(dá)量高于乙醇對(duì)照組(P＜0.001)。清香散各劑量組與柳氮磺胺吡啶組IL-1βmRNA表達(dá)量低于TNBS模型對(duì)照組(P＜0.001)。以上結(jié)果表明清香散能下調(diào)TNBS模型大鼠腸組織IL-1βmRNA表達(dá)。 9、清香散對(duì)TNBS致結(jié)腸炎模型大鼠腸組織NF-KappB活性的影響：NF-κB是一個(gè)普遍存在的轉(zhuǎn)錄因子，

16、廣泛參與多種基因特別是免疫炎癥反應(yīng)相關(guān)基因如各種炎癥細(xì)胞因子、趨化因子、粘附因子的表達(dá)調(diào)控，影響炎癥反應(yīng)過(guò)程。 結(jié)論 以上運(yùn)用清熱祛濕法及其代表方清香散對(duì)TNBS致結(jié)腸炎模型大鼠初步的治療結(jié)果及療效機(jī)制如下： 1、清香散能增加造模術(shù)后7天內(nèi)TNBS模型大鼠的體重，降低其造模術(shù)后第7天時(shí)疾病活動(dòng)指數(shù)，減輕其造模術(shù)后第7天時(shí)粘膜損害及組織學(xué)病理?yè)p害，降低造模術(shù)后第7天時(shí)組織中MPO活力。提示清香散對(duì)TNBS模型大鼠急

17、性期療效確切。 2、清香散能增加造模術(shù)后第7天時(shí)TNBS模型大鼠結(jié)腸組織中SOD活力而降低其MDA含量，表明其能提高TNBS模型大鼠腸組織清除活性氧及自由基的能力。提示清香散增強(qiáng)清除活性氧及自由基能力可能為其治療炎癥性腸病急性期的機(jī)制之一。 3、清香散能降低造模術(shù)后第7天TNBS模型大鼠結(jié)腸組織中NOS活力及NO含量。提示清香散降低NOS活力與NO過(guò)度表達(dá)可能為其治療炎癥性腸病急性期的機(jī)制之一。 4、清香散能下調(diào)