硫唑嘌呤治療炎癥性腸病療效及安全性監(jiān)測體系的建立.pdf

1、炎癥性腸病(Inflammatory Bowel Disease，IBD)包括克羅恩病(Crohn’s disease，CD)和潰瘍性結(jié)腸炎(Ulcerative colitis，UC)，是以腸道免疫功能紊亂為主的非特異性炎性疾病。 在炎癥性腸病的藥物治療中，免疫抑制劑如硫唑嘌呤(Azathioprine，AZA)，6-巰嘌呤(6-mercaptopurine，6-MP)等有著不可替代的作用。循證醫(yī)學(xué)證明免疫抑制劑能有效誘導(dǎo)和維

2、持IBD的緩解，并減少激素依賴[3-5]。但是AZA和6-MP的治療存在很大的個體差異。在活動期患者的治療中，約2／3的患者能誘導(dǎo)緩解，15％患者完全無效，而約有9-28％的患者在治療過程中發(fā)生了嚴(yán)重的副反應(yīng)，如骨髓抑制和肝臟毒性[6，7]。藥物個體療效的不確定性和對于藥物嚴(yán)重毒副作用的顧慮都限制了AZA及6-MP在IBD患者中的使用，因而降低了IBD患者的治療質(zhì)量，在國內(nèi)這一矛盾尤其突出。 AZA類藥物治療的個體差異與其代謝途

3、徑密不可分。AZA及6-MP本身均無活性，必須經(jīng)過體內(nèi)一系列酶代謝途徑，最終生成活性產(chǎn)物6-硫基鳥嘌呤核苷酸(6-thioguanine nuclcotides，6-TGNs)而產(chǎn)生細(xì)胞毒效應(yīng)而發(fā)揮療效，但亦是骨髓抑制的主要原因。而硫嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶(thiopurine S-methyltmnsferase，TPMT)是AZA及6-MP藥物代謝途徑中重要的代謝酶，競爭性抑制6-TGNs的生成，并與AZA類藥物毒副作用及療效有著重要關(guān)系。

4、1980年Weinshiboum首先報道高加索人種中TPMT的活性具有多態(tài)性[8]。高加索人種中TPMT活性呈三態(tài)分布，大約0.3％的高加索人為TPMT酶活性減低或缺乏，11.1％酶活性中等，88.6％呈正?；蚋呋钚浴．?dāng)接受推薦劑量的AZA類藥物治療時，若TPMT活性降低或缺乏，會生成過多的6-TGNs，骨髓抑制的風(fēng)險就會大大增加[9，10]；若TPMT活性過高，一方面不能生成足夠的6-TGNs，達(dá)到有效的治療效果[11-13]，另一方

5、面，會生成過多的6-甲基巰嘌呤核糖核酸(6-methylmercaptopurine nucleotides，6-MMPR)，可能導(dǎo)致肝臟毒性的發(fā)生[14,15]。 TPMT基因多態(tài)性是TPMT活性差異的遺傳基礎(chǔ)。TPMT基因突變導(dǎo)致TPMT活性下降[8]。研究顯示，TPMT表型與基因型檢測結(jié)果的一致率達(dá)到了98.4％[16]。TPMT野生純合子對應(yīng)于TPMT高活性，突變雜合子對應(yīng)于TPMT中等活性，突變純合子對應(yīng)于TPMT活性缺乏[1

6、1,17]。目前已發(fā)現(xiàn)20余種TPMT突變等位基因(*2，*3A,*3B，*3C，*3D，*4-*19)可能與酶活性降低和／或AZA類藥物毒副作用有關(guān)[18]。其中在高加索人種中TPMT*2(G238C)，*3A(G460A及A719G)，*3B(G460A)，"3C(A719G)四種突變最為常見，占了約95％[19]。 因此為了了解中國IBD患者的治療現(xiàn)狀，研究中國漢族IBD患者TPMT基因多態(tài)性分布狀況及其與健康人群分布差異

7、，以及TPMT遺傳多態(tài)性與藥物毒副作用及療效的關(guān)系，從而提高用藥安全性，建立個體化治療方案，我們設(shè)計了以下四個步驟的研究。 首先，為了了解IBD的治療現(xiàn)狀，我們進(jìn)行了以醫(yī)院為基礎(chǔ)的IBD患者治療現(xiàn)狀的回顧性研究。對收治浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬邵逸夫醫(yī)院的177例IBD患者(71例CD，106例UC)的臨床特征及藥物治療包括5一氨基水楊酸制劑、糖皮質(zhì)激素、灌腸、免疫抑制劑的治療情況進(jìn)行了分析，并建立了IBD患者數(shù)據(jù)庫軟件系統(tǒng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)部

8、分IBD患者沒有得到指南所推薦的治療。27.8％的重度患者未得到靜脈或口服糖皮質(zhì)激素的治療。遠(yuǎn)端或左半結(jié)腸炎患者只有54.4％的患者給予了灌腸治療，美沙拉嗪灌腸治療使用率更低。特別是免疫抑制劑的使用率低下，在有使用免疫抑制劑治療適應(yīng)癥的患者中，只有19.6％接受了免疫抑制劑的治療，且藥物劑量不足。中國IBD患者免疫抑制劑的低使用率源于臨床缺乏該類藥物安全性的檢測手段，如TPMT基因多態(tài)性的檢測。那么作為有潛在使用AZA治療可能的人群，中

9、國IBD患者TPMT基因多態(tài)性的分布如何，是否與健康人相近呢? 第二步，我們運用引物特異性多聚酶鏈反應(yīng)(allele-specific polymerase reaction chain)及多聚酶鏈反應(yīng)一限制性片段長度多態(tài)性分析(polymerase reaction chain-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP)方法，對來自中國浙江地區(qū)的189例IBD患者及27

10、3例健康漢族人進(jìn)行了TPMT基因單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms，SNPs)檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)中國漢族IBD患者和健康人群存在的最主要的TPMT突變等位基因為TPMT*3C，未發(fā)現(xiàn)TPMT*2，TPMT*3A，TPMT*3B突變存在。健康漢族人群。TPMT*3C突變等位基因頻率為1.47％，總的突變等位基因頻率低于高加索人種。IBD患者TPMT*3C突變等位基因頻率1.59％，與健康對照組相近(

11、p=1.000)。UC組TPMT*3C突變等位基因頻率為2.45％，高于CD組(0.57％)，但兩組之間分布比較無統(tǒng)計學(xué)差異(p=0.147)。了解了中國漢族IBD患者TPMT基因多態(tài)性分布情況后，我們發(fā)現(xiàn)該人群突變等位基因頻率低于高加索人種。這一結(jié)果是否預(yù)示著中國漢族IBD患者使用AZA治療更安全，藥物毒副作用發(fā)生率低呢?在臨床中AZA類藥物的安全性到底如何，TPMT基因多態(tài)性與AZA藥物毒副作用的相關(guān)性如何，是否可以通過基因多態(tài)性檢

12、測來預(yù)測AZA的藥物毒副作用呢?為解決這一問題，我們進(jìn)行了TPMT*2，*3A，*3B，*3C突變等位基因與AZA藥物毒副作用的相關(guān)性研究。 第三步，我們對43例接受AZA維持治療的IBD患者監(jiān)測骨髓抑制及肝臟毒性的發(fā)生情況，并運用引物特異性PCR及PCR-RFLP方法檢測TPMT*2,TPMT*3A，TPMT*3B，TPMT*3C四種TPMT突變等位基因，進(jìn)一步對5例發(fā)生藥物毒副作用的患者進(jìn)行。TPMT外顯子測序，并分析AZA

13、藥物毒副作用與TPMT基因多態(tài)性之間的相關(guān)性。結(jié)果在對43例接受AZA治療的IBD患者的隨訪中，觀察到有4例患者發(fā)生了骨髓抑制，1例發(fā)生了肝臟毒性。而基因多態(tài)性檢測發(fā)現(xiàn)該5例患者均不存在TPMT*2，*3A，*3B，*3C這4種常見的TPMT突變等位基因。進(jìn)一步對該5例患者進(jìn)行外顯子測序工作，發(fā)現(xiàn)其中3例患者存在TPMT*1S突變雜合子，即7號外顯子17772479 T→C突變，導(dǎo)致cDNA 474位T→C改變，但是編碼的第158個氨基

14、酸仍為異亮氨酸，沒有發(fā)生改變，為無義突變。在第三部分對AZA治療的IBD患者的基因多態(tài)性與藥物毒副作用關(guān)系的研究中，我們發(fā)現(xiàn)AZA藥物毒副作用無法完全通過TPMT基因突變來解釋。而TPMT活性除基因多態(tài)性外，還受到其他多種因素例如未知突變、藥物間相互作用的影響。那么在中國漢族IBD患者中是否可以直接通過TPMT活性檢測來預(yù)測AZA的藥物毒副作用，TPMT活性與AZA藥物療效的關(guān)系又如何呢? 第四步，我們采用反相高效液相色譜法(H

15、igh performance liquid chromatography，HPLC)檢測紅細(xì)胞內(nèi)TPMT活性，初步探討中國漢族IBD患者，IPMT活性與AZA藥物毒副作用及療效的關(guān)系。以13例服用AZA治療的IBD患者為研究對象，運用高效液相色譜法測定紅細(xì)胞內(nèi)TPMT的活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)發(fā)生早期骨髓抑制的3例患者TPMT平均活性低于沒有發(fā)生骨髓抑制的患者(9.3±2.1 U／mlpRBC vs 18.0±6.2 U/ml pRBC;p=0

16、.046)，并且低于早期未發(fā)生骨髓抑制的患者組(9.3±2.1 U／ml pRBC vs 17.7±5.5 U／ml pRBC;p=0.029)。發(fā)生肝臟毒性的患者1例，TPMT活性為28.8 U／ml pRBC，明顯高于沒有發(fā)生肝臟毒性的患者(14.7+4.8U／ml pRBC)。其中有3例發(fā)生骨髓抑制的患者在AZA減量至50mg/d后能夠耐受維持治療。AZA治療中維持緩解的IBD患者TPMT活性顯著低于沒有誘導(dǎo)緩解的患者(13.7±

17、3.5 U／ml pRBC Vs 22.0±5.5 U／ml pRBC; p=0.009)。 以醫(yī)院為基礎(chǔ)的IBD患者治療現(xiàn)狀研究顯示，部分IBD患者未得到理想治療。尤其是對AZA類藥物毒副作用的顧慮限制了免疫抑制劑的使用，降低了IBD的治療質(zhì)量，主要原因是臨床缺乏相應(yīng)的預(yù)測方法。在第二、三、四部分的研究中，我們建立了可靠的TPMT基因多態(tài)性及酶活性的檢測方法。發(fā)現(xiàn)漢族IBD患者TPMT突變等位基因頻率較低，且對發(fā)生藥物毒副作用