硫嘌呤類藥物安全性監(jiān)測體系的建立.pdf

1、抗代謝藥：硫鳥嘌呤(6-thioguanine,6-TG)，6-巰基嘌呤（6-mercaptopurine,6-MP)及硫唑嘌呤(Azathioprine,AZA)均為嘌呤拮抗劑，這類藥物通過干擾嘌呤代謝的所有環(huán)節(jié)，抑制嘌呤核苷酸的合成，進而抑制細胞DNA、RNA及蛋白質(zhì)的合成。在臨床上，硫嘌呤類藥物除用于治療急性白血病外，主要作為免疫抑制劑廣泛用于器官移植以及自身免疫疾病的治療。但是此類藥物的治療存在很大的個體差異。藥物個體療效的不確

2、定性和對于藥物嚴(yán)重毒副作用的顧慮都限制了硫嘌呤類藥物在患者中的使用，主要原因是臨床缺乏相應(yīng)的預(yù)測方法，這一矛盾在國內(nèi)尤為突出。
　　 目前，臨床上通過定期監(jiān)測服用硫嘌呤類藥物患者的血象來指導(dǎo)其合理用藥。研究發(fā)現(xiàn)藥物活性物質(zhì)的水平和降低的紅細胞計數(shù)、降低的血小板計數(shù)、降低的白細胞計數(shù)、降低的中性粒細胞計數(shù)呈正相關(guān)[1]。因此定期進行常規(guī)的血細胞計數(shù)有助于診斷此類藥物的血液毒性，但是常規(guī)的血象監(jiān)測難以預(yù)測毒性的危險性，通常在血細胞計

3、數(shù)發(fā)生改變之前,骨髓已受到一定損害，在血常規(guī)改變之后，骨髓的造血功能已受嚴(yán)重影響，血中藥物活性物質(zhì)濃度已高出正常治療濃度[2]，導(dǎo)致硫嘌呤類藥物不良反應(yīng)增多，甚至造成嚴(yán)重的醫(yī)療事故。眾多研究表明，硫嘌呤類藥物治療的個體差異與其代謝途徑密不可分。這類藥物本身均無生物活性，必須經(jīng)過體內(nèi)一系列的酶代謝途徑，最終生成有活性的6-硫代鳥嘌呤核苷酸(6-thioguanine nucleotides,6-TGNs)產(chǎn)生細胞毒效應(yīng)而發(fā)揮療效，但其亦是

4、骨髓抑制的主要原因。6-TGNs在體內(nèi)的濃度決定了此類藥物的有效性和毒性。而巰嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶(thiopurine methyltransferase,TPMT)作為硫嘌呤類藥物代謝途徑中重要的代謝酶，競爭性抑制6-TGNs的生成，進而影響藥物的療效及毒副作用。臨床研究表明，TPMT 活性在不同個體之間有很大的差異。如果患者TPMT 活性較低或遺傳有TPMT 缺陷,即使給予常規(guī)劑量的藥物，也會生成過多有活性的6-TGNs,大大增加了骨髓

5、抑制的風(fēng)險[3,4]，另一方面，具有TPMT 高活性的患者，在常規(guī)劑量下卻很難達到治療效果，而且過多的甲基化產(chǎn)物的生成可能導(dǎo)致肝臟毒性的發(fā)生[5,6]。
　　 TPMT基因多態(tài)性是造成TPMT 酶活性個體差異的主要原因，目前對于中國漢族健康人群的TPMT 活性分布及基因多態(tài)性分布情況已見報道，漢族健康人群的TPMT 活性呈正態(tài)分布，且TPMT*3C為最主要的突變等位基因[7]。TPMT基因突變導(dǎo)致TPMT 活性降低[8]，TPM

6、T 野生純合子對應(yīng)TPMT 高活性，TPMT*3C 突變基因雜合個體顯示TPMT中等活性，而突變純合子對應(yīng)TPMT 活性缺乏。鑒于以上情況，本研究對收集的114例自身免疫疾病患者進行了TPMT*3C的篩選和TPMT 酶活性的檢測，以期建立硫嘌呤類藥物安全性監(jiān)測體系，為臨床提供個體化用藥依據(jù)。
　　 1.建立引物特異性TaqMan 聚合酶鏈反應(yīng)檢測TPMT*3C 突變1.1標(biāo)本來源114例自身免疫疾病患者，包括39例類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎

7、，33例白塞綜合癥，22例干燥綜合癥，20例間質(zhì)性肺炎。所入選的患者均為漢族人，性別、身高、體重不限，年齡范圍3 —68，性別男性87例，女性27例。以直接調(diào)查方式獲得相關(guān)資料，包括：年齡、性別、體重、民族、合并藥物以及不良反應(yīng)等。
　　 2.建立高效液相色譜法（HPLC）測定TPMT 活性
　　 3種濃度的6-MMP 標(biāo)準(zhǔn)溶液10μl （使孵化反應(yīng)后0.5ml 反應(yīng)液中6-MMP的濃度分別為140，112，35μg/L

8、），再按上述血標(biāo)本處理方法操作（不加入底物6-MP）并進行分析，求得6-MMP在紅細胞裂解液中的回收率。在同一天內(nèi)和不同天間對以上3個濃度的6-MMP 標(biāo)準(zhǔn)紅細胞裂解液樣品重復(fù)處理5 批（不加入底物6-MP），并進樣分析，求日內(nèi)和日間RSD。
　　 結(jié)論：
　　 （1）本研究所建立的引物特異性TaqMan 聚合酶鏈反應(yīng)（PS-TaqMan PCR）法用于檢測TPMT*3C 突變。該方法可靠、高通量且效率高，與傳統(tǒng)的聚合酶

9、鏈反應(yīng)—限制性片段長度多態(tài)性(PCR —RFLP)法相比，省去了繁瑣的操作，更簡便、準(zhǔn)確，更適合大規(guī)模的臨床樣本分析。
　　 （2）對已經(jīng)服用硫嘌呤類藥物的患者，因此類藥物自身的干擾影響TPMT 活性測定的結(jié)果，建議通過檢測TPMT*3C的突變?yōu)榕R床用藥提供依據(jù)。
　　 （3）由于篩查出的TPMT*3C基因突變例數(shù)太少，在本研究中還不能得出TPMT*3C突變雜合子TPMT平均活性明顯低于野生型TPMT基因（TPMT*1）

10、純合子的TPMT平均活性。因此還有待于大樣本的進一步研究。
　　 （4）對未服用硫嘌呤類藥物的患者，因TPMT 活性能較好的預(yù)測早期藥物毒副作用的發(fā)生及治療療效，指導(dǎo)藥物治療劑量，建議通過測定TPMT的活性為臨床個體化給藥提供依據(jù)。
　　 （5）本實驗所建立的HPLC 用甲硝唑做內(nèi)標(biāo)測定紅細胞裂解液中6-MMP濃度,兩者分離較好，且紅細胞裂解液中的內(nèi)源性雜質(zhì)不干擾6-MMP的測定。6-MMP在14～224μg/L內(nèi)具有良