U0126對大鼠油酸性急性肺損傷早期水通道白4在肺水代謝的表達差異.pdf

1、研究目的: 急性肺損傷/急性呼吸窘迫綜合征（Acute Lung Injury/Acute Respiratory Distress Syndrome，ALI/ARDS），是臨床常見急性呼吸衰竭的兩個階段，由心源性以外的各種肺內外致病因素所導致的急性、進行性缺氧性呼吸衰竭，以肺水腫、呼吸困難、嚴重低氧血癥為特征性的臨床表現(xiàn)。病理生理上主要表現(xiàn)為肺泡毛細血管屏障破壞，以及肺泡腔內高蛋白性水腫。臨床死亡率高達35-58%，是住院病人

2、后期死亡原因之一。臨床研究表明，急性呼吸窘迫綜合癥（ARDS）的患者肺泡內液體的早期重吸收是治療關鍵。研究早期肺泡上皮細胞清除功能，對肺水代謝過程中ALI/ARDS的轉歸有重要意義。 肺泡Ⅱ型細胞（AT-Ⅱ）雖然只占肺泡表面積5%，但數(shù)量占到了60%，其功能包括液體轉運；分泌表面活性物質；肺損傷時增生轉化為Ⅰ型細胞等。本實驗著重研究肺泡Ⅱ型細胞的液體轉運功能。 Ⅱ型肺泡上皮細胞基底側膜的Na+-K+-ATP酶將鈉離子泵出

3、至間質，造成細胞內鈉離子濃度降低，肺泡腔內的鈉離子順電勢差經上皮鈉通道進入細胞；水分子在滲透壓差的作用下經水通道進入細胞或細胞間質轉運。疾病早期肺水腫的肺泡Ⅱ型細胞肺泡水重吸收是修復肺損傷的修復關鍵一步。 水通道在滲透性水通透中起易化作用，使水通過生物膜的速度遠遠超過彌散速度。但在病理損傷的情況下，尤其是早期水通道蛋白的調節(jié)機制尚不十分明確，基于已認識到水通道蛋白具有主動吸收水的作用，也已證實肺組織中存在1、3、4、5、8、9水

4、通道蛋白等6種水通道。但在肺損傷后，水通道蛋白在肺水腫時如何變化尚未研究。 因此，本研究選擇了在肺泡細胞中具有“干細胞”作用、又廣泛覆蓋于肺泡表面直接面對肺泡液體的肺泡Ⅱ型上皮細胞作為靶目標。前期工作已證明肺泡Ⅱ型上皮細胞也存在AQP1及AQP4；目前以AQP4為主要研究對象，在液體清除中各發(fā)揮何種作用，在正常、肺損傷早期及使用U0126抑制其MAPKs信號轉導通路之一，研究MAPKs通路阻斷前后，肺泡Ⅱ型細胞上AQP-4及其m

5、RNA量的表達變化，探討MAPKs信號通路與肺泡Ⅱ型細胞上AQP-4的聯(lián)系及其可能的分子機制，以期進一步了解MAPKs在ARDS狀態(tài)下水通道蛋白的作用，從而為治療ARDS找到新的藥物靶點。 研究方法： 健康Sprague-Dawley大鼠（南方醫(yī)科大學實驗動物中心提供），體重180～220克。按隨機數(shù)字表法將動物分為3組：對照組、油酸復制ALI/ARDS肺損傷模型組、油酸+U0126氣道給藥組，對照組和油酸組各28只大鼠

6、，加藥組25只，共81只。實驗步驟大致如下： 復制油酸ARDS大鼠模型：油酸是一種具有較強毒性的飽和脂肪酸，進入機體后會造成肺組織損傷誘發(fā)并擴大氧化性肺損傷。是目前公認較好的ARDS模型，尾靜脈注射油酸0.1ml/kg，30分鐘后放血活殺。通過動脈血氣分析、EVLW檢測、HE病理染色等指標來判斷模型是否成功建立及大鼠肺損傷的程度。 ATⅡ細胞的分離、純化和鑒定：采用改良的胰酶消化法分離肺泡Ⅱ型上皮細胞，用大鼠IgG免疫粘

7、附法純化細胞，臺盼蘭測細胞活力，改良的鞣酸染色法、AKP染色法及透射電鏡鑒定細胞純度。 EVLW的測定：重力法測定EVLW。在靜水壓和膠體滲透壓綜合作用下，滲出的液體減去淋巴管轉移入血管的部分為血管外肺水。根據(jù)公式計算EVLW含量。 大鼠肺泡Ⅱ型上皮AQP-4 mRNA的表達。AQP-4在肺泡Ⅱ型上皮細胞mRNA表達的測定：Trizol提取總RNA，紫外線分光光度儀檢測其濃度。逆轉錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）檢測AQ

8、P-4 mRNA的表達。采用GELPRO32圖像分析系統(tǒng)行密度掃描，計算AQP-4 mRNA產物與β-actin產物吸光度積分的比例，作為AQP-4 mRNA表達水平，從而比較正常組、油酸組、油酸+U0126組之間AQP-4 mRNA表達量的變化。 研究結果： 1.動物ALI/ARDS模型的成功建立經尾靜脈注入油酸0.1 ml/kg后，所有大鼠均在30s-3 min內出現(xiàn)明顯呼吸加快，淺促，口唇皮膚以及四肢發(fā)紺，氣管插管

9、內分泌物明顯增多等臨床表現(xiàn)。氣管插管直接呼吸空氣情況下，PH（7.16±0.132）、P02（57.51±4.644）mmHg，顯著低于正常組（P=0.000），PaO2/FiO2≤300符歐美關于ALI的診斷標準。對照組肺間質及肺泡內無水腫、炎癥，肺泡相對干燥。油酸組可見肺間質及肺泡內有小量出血，可見炎性細胞增多；肺泡隔增寬，肺間質滲液明顯，油酸+U0126組肺組織病理表現(xiàn)同油酸肺損傷組。 2.大鼠ATⅡ細胞的分離純化方法是可

10、行的，經臺盼蘭染色對照組細胞活力88.6±2.67%，ARDS組85.8±3.36%，改良的鞣酸染色法可見不均勻分布在核周的大小不一的褐色的嗜鋨小體（板層小體），細胞聚集成島狀。AKP染色法可見胞漿中有較多分不不均，大小不一的藍色顆粒。電鏡下見正常組細胞形態(tài)較規(guī)則，呈圓形或立方形，表面有很多長短不一的微絨毛，核圓形，胞質著色淺，呈泡沫狀。細胞質內含許多線粒體、粗面內質網(wǎng)、高爾基復合體和溶酶體；并可見特征性的嗜鋨性板層小體。電鏡下見油酸組

11、細胞變性、凋亡甚至崩解，細胞形態(tài)相對不規(guī)則，表面的微絨毛明顯減少，胞核變形，染色質邊集，線粒體腫脹，胞漿內各種細胞器明顯減少， 板層小體排空顯著增多而致空泡化并可見到脫落的板層小體。 3.EVLW的含量損傷模型組0.8175±0.111明顯高于對照組0.515±0.962，加藥組0.820±0.590與模型組無明顯差別，說明在肺損傷早期，就已經存在明顯肺泡毛細血管大量滲出，滲出大于重吸收和間質回流，給藥組并不能明顯增強肺泡上皮液

12、體清除能力。 4.經過RT-PCR擴增后，AQP-4產物與β-actin產物吸光度積分的比例，作為AQP-4的m-RNA表達水平，對照組0.280±0.096，模型組為0.810±0.129，加藥組0.502±0.123 （F=46.815，P=0.000），油酸組合成表達明顯增加，加藥組合成表達量介于模型組和正常組之間，三者之間比較差異都有統(tǒng)計學意義。說明AT Ⅱ細胞核內合成AQP4的mRNA合成表達量在肺水腫各種因素的作用下

13、表量是增加的；其次，給藥組表達量較油酸組減少，說明藥物影響AQP4的mRNA。 結論： 1.采用改良的胰酶消化法可以成功分離正常和油酸ARDS大鼠的AT Ⅱ細胞，用大鼠IgG包被培養(yǎng)皿純化細胞、改良的鞣酸染色法鑒定細胞純度簡單可行，透射電鏡是鑒定細胞的金標準，而APK染色鑒定ATⅡ可以與透射電鏡相媲美。 2.經尾靜脈注射油酸復制大鼠ARDS急性模型是一個相對簡單而成功率高的方法，大鼠血液PaO2顯著下降，PaCO

14、2顯著上升，肺部出現(xiàn)明顯病理改變，上皮細胞的超微結構出現(xiàn)明顯早期壞死的表現(xiàn)，血氣分析、光鏡下肺損傷評分及EVLW油酸組嚴重程度顯著高于對照組，顯微鏡下肺泡Ⅱ型上皮細胞的數(shù)量較對照組無明顯減少，但電鏡下細胞的超微結構如板層小體排空，線粒體損傷，符合肺損傷及急性呼吸窘迫綜合征的診斷標準。 3.通過氣管插管給予U0126直接抑制MAPKs信號轉導通路中MEK活性后，復制的大鼠ARDS，從肺組織大體形態(tài)、血氣分析、病理、肺泡Ⅱ型上皮細胞

15、電鏡下形態(tài)等來看，與油酸組無明顯差別，肺毛細血管滲透性下降，間質水腫明顯，肺泡上皮細胞主動重吸收較油酸組無明顯加強，體現(xiàn)在血管外肺水并未明顯下降，說明給予U0126直接抑制MAPKs信號轉導中MEK活性后，早期并未明顯改善油酸所致大鼠肺水腫液體重吸收。但肺泡Ⅱ型上皮細胞中AQP4的mRNA表達量在U0126組較油酸組表達量明顯減少，因而可以知道在ARDS形成中，MAPKs信號轉導途徑可以調節(jié)早期ARDS大鼠的肺泡Ⅱ型上皮細胞中AQP4的