大鼠肝臟缺血再灌注不同時(shí)限缺氧誘導(dǎo)因子1的表達(dá)變化及意義探討.pdf

1、隨著現(xiàn)代臨床外科的進(jìn)步，肝臟缺血再灌注損傷(hepatic ischemia andreperfusion injury，HIRI)在肝臟外科及肝臟移植中的作用越來越受到重視，對其損傷機(jī)制的研究也較多。肝臟血流減少及隨后的再灌注期的微循環(huán)紊亂等均導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的缺氧環(huán)境，必然會(huì)引起維持機(jī)體氧平衡的重要調(diào)節(jié)蛋白缺氧誘導(dǎo)因子-1(hypoxia inducible factor-1，HIF-1)的表達(dá)變化。目前對肝臟缺血再灌注期HIF-1的時(shí)程

2、表達(dá)特點(diǎn)及意義尚不清楚，少有文獻(xiàn)報(bào)道。故本實(shí)驗(yàn)旨在研究肝臟缺血再灌注期HIF-1的時(shí)空表達(dá)特點(diǎn)及作用意義，以及其表達(dá)與HIRI過程中細(xì)胞損傷及細(xì)胞凋亡的關(guān)系，為肝臟缺血再灌注損傷的防治探索新的方向。
　　 實(shí)驗(yàn)一 HIF-1α在大鼠肝臟不同缺血時(shí)限的表達(dá)變化及意義。
　　 一、目的：
　　 建立大鼠肝臟缺血損傷模型，檢測HIF-1α和Caspase-3蛋白在肝臟不同缺血時(shí)限的表達(dá)變化并探討其意義。
　　

3、二、方法：
　　 1.健康SD大鼠35只隨機(jī)分為正常組(5只)、假手術(shù)組(15只)、缺血組(15只)，假手術(shù)組及缺血組又按不同缺血時(shí)限分為30min、45min、60min三個(gè)亞組，每組5只大鼠，制備大鼠全肝血流阻斷模型。
　　 2.血液標(biāo)本由肝上下腔靜脈抽取約2ml，檢測血清ALT值。
　　 3.大鼠肝臟標(biāo)本取材后經(jīng)10％福爾馬林固定，電鏡標(biāo)本取材后即放入預(yù)先配置的3％戊二醛中固定20min后進(jìn)行修塊取材。

4、r>　　 4.HE染色及免疫組織化學(xué)均按試劑盒內(nèi)操作步驟進(jìn)行，兔抗大鼠HIF-1α和Caspase-3的工作濃度為1:100，均購于武漢博士德生物工程有限公司。
　　 5.光鏡及電鏡下進(jìn)行病理組織學(xué)觀察，免疫組織化學(xué)SABC法檢測HIF-1α和Caspase-3在肝臟不同缺血時(shí)限的表達(dá)量，采用HPIAS-1000高清晰彩色病理圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行定量檢測。
　　 6.所有計(jì)量數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS11.5進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，采取析因

5、設(shè)計(jì)方差分析分析主效應(yīng)與交互效應(yīng)后，LSD法檢驗(yàn)各組間差別，P<0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 三、結(jié)果：
　　 1.正常組與假手術(shù)組的HIF-1α表達(dá)比較，其差別均不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。各時(shí)限缺血組與假手術(shù)組相比，其結(jié)果具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)。自缺血30min后HIF-1α蛋白的表達(dá)即顯著增加，且隨缺血時(shí)限的延長呈逐漸上升趨勢。在區(qū)域分布上可見，缺血30min時(shí)HIF-1α蛋白主要表達(dá)在匯管

6、區(qū)門靜脈、微血管、微膽管周圍的細(xì)胞內(nèi)，部分細(xì)胞內(nèi)呈強(qiáng)陽性表達(dá)。缺血45min時(shí)，表達(dá)區(qū)域逐漸向小葉間中央靜脈區(qū)蔓延，缺血60min時(shí)，中央靜脈內(nèi)皮細(xì)胞及其周圍肝細(xì)胞中都可見到HIF-1α蛋白陽性表達(dá)。
　　 2.正常組與假手術(shù)組中Caspase-3蛋白陽性表達(dá)量較少，相比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。各時(shí)限點(diǎn)的缺血組與假手術(shù)組相比，均具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)。隨著缺血時(shí)限的延長，各缺血組Caspase-3的表達(dá)量在

7、統(tǒng)計(jì)學(xué)上無差異(P>0.05)。陽性細(xì)胞主要出現(xiàn)在肝竇狀內(nèi)皮細(xì)胞中。
　　 3.缺血組血清ALT水平均高于正常組及假手術(shù)組，隨著缺血時(shí)限的增加，ALT逐漸上升，組織病理學(xué)損傷亦呈加重趨勢。
　　 四、討論：
　　 本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，單純的手術(shù)損傷未影響到肝臟的血供時(shí)，不會(huì)引起肝臟組織及細(xì)胞的損傷，故血清ALT值處于正常水平，作為機(jī)體缺氧調(diào)控因子的HIF-1α蛋白的表達(dá)量極低，凋亡執(zhí)行蛋白Caspase-3的表達(dá)

8、量也處于基線水平。一旦肝臟遭受缺血性損傷，即有HIF-1α蛋白應(yīng)激性的顯著表達(dá)上調(diào)，HIF-1α蛋白的積聚量與肝功能變化及細(xì)胞形態(tài)學(xué)損傷的程度呈一定的相關(guān)性，因此急性缺血期HIF-1α的表達(dá)強(qiáng)度可以作為反映機(jī)體缺氧損傷程度的一個(gè)敏感指標(biāo)。大鼠遭受突發(fā)30min的肝缺血，即可使Caspase-3顯著性表達(dá)上調(diào)，活化凋亡程序。因此，如何阻止肝竇內(nèi)皮細(xì)胞中Caspase-3蛋白的表達(dá)上調(diào)與激活，可以作為減輕肝臟缺血損傷的防治方向之一。

9、　　 實(shí)驗(yàn)二 HIF-1α在大鼠肝臟缺血45min再灌注不同時(shí)限表達(dá)變化及意義探討。
　　 一、目的：
　　 建立大鼠肝臟缺血再灌注損傷模型，用免疫組織化學(xué)SABC法檢測HIF-1α和Caspase-3蛋白在肝臟缺血45min再灌注不同時(shí)限的表達(dá)變化并探討其意義，并觀察丹參預(yù)處理對它們表達(dá)的影響。
　　 二、方法：
　　 1.健康SD大鼠80只隨機(jī)分為正常組(5只)、假手術(shù)組(25只)、缺血再灌注組(2

10、5只)，丹參處理組(25只)，假手術(shù)組、缺血再灌注組及丹參處理組又按不同再灌注時(shí)限(0h、3h、12h、24h、72h)分為五個(gè)亞組，每組5只大鼠。
　　 2.模型制備、取材方法、HE染色及免疫組織化學(xué)染色步驟、觀察方法及統(tǒng)計(jì)學(xué)處理等，同實(shí)驗(yàn)一。
　　 三、結(jié)果：
　　 1.HIF-1α在正常組與假手術(shù)組中陽性表達(dá)極弱，兩者比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，在缺血后HIF-1α表達(dá)即明顯增加，至再灌注12h后達(dá)到

11、峰值，與同期假手術(shù)組比較均有顯著性差異(P<0.01)，再灌注24h后回落至基線水平。丹參處理組在再灌注0h、3h可上調(diào)HIF-1α表達(dá)，在再灌注12h時(shí)下調(diào)HIF-1α的表達(dá)，與同期缺血再灌注組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)至再灌注24h亦回落至基線水平。
　　 3.Caspase-3在正常組與假手術(shù)組間表達(dá)亦無差別，兩者比較(P>0.05)，缺血后Caspase-3的表達(dá)迅速增加，至再灌注24h時(shí)達(dá)到峰值，與同期假手術(shù)組

12、比較均具有顯著性差異(P<0.01)，再灌注72小時(shí)后回落至基線水平。丹參處理組與同期缺血再灌注組相比，均較低，兩者具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。
　　 3.病理形態(tài)學(xué)觀察可見，肝臟經(jīng)過缺血損傷后，隨著再灌注時(shí)限的延長，組織及細(xì)胞損傷逐漸加劇，至再灌注24h時(shí)達(dá)到損害的頂峰，至再灌注72h損傷逐漸恢復(fù)至正常，丹參處理組較同時(shí)限點(diǎn)再灌注組損傷輕。
　　 四、結(jié)論：
　　 肝臟缺血損傷和再灌注損傷是一個(gè)密切聯(lián)系、極

13、其復(fù)雜的病理生理過程，有多種因素共同參與，HIF-1α和Caspase-3也參與此過程中。本實(shí)驗(yàn)通過對大鼠肝臟缺血45min再灌注0～72h內(nèi)HIF-1α、Caspase-3及同期病理形態(tài)學(xué)損傷的觀察，分析歸納該過程可能經(jīng)歷以下四期：①缺氧應(yīng)激期(0～3h)，此期HIF-1α和Caspase-3表達(dá)迅速增強(qiáng)，鏡下可見細(xì)胞及細(xì)胞器出現(xiàn)腫脹，肝竇間隙變窄，體現(xiàn)此期肝臟組織對缺氧損傷及氧化損傷迅速發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)。②過度反應(yīng)期(3～12h)，此期

14、HIF-1α的表達(dá)繼續(xù)增強(qiáng)，在12h時(shí)達(dá)峰值，并波及到肝臟的各個(gè)區(qū)域，Caspase-3亦繼續(xù)增強(qiáng)表達(dá)，鏡下可見部分區(qū)域細(xì)胞的腫脹更加明顯，部分區(qū)域細(xì)胞胞核可見皺縮。③繼續(xù)損傷期(12～24h)，此期HIF-1α蛋白表達(dá)逐漸減弱，至24h時(shí)已接近于基線水平，而Caspase-3繼續(xù)增強(qiáng)表達(dá)，24h時(shí)達(dá)峰值，鏡下可見此期組織細(xì)胞損傷逐漸加重，于24h左右組織損傷最重。④恢復(fù)期(24h～72h)，此期Caspase-3蛋白也逐步回落至基線水