IAP B聚體的各亞基克隆及表達(dá)的初步研究.pdf

1、本研究用含有去纖維綿羊血的B-G培養(yǎng)基活化百日咳桿菌后，用改良的S-S液體培養(yǎng)基成功培養(yǎng)出不含其它培養(yǎng)基成分污染的百日咳桿菌。通過比較小批量細(xì)菌DNA提取法與CTAB法提取法發(fā)現(xiàn)，CTAB法提取的基因組DNA具有純度高、片段大的優(yōu)點(diǎn)。 在對(duì)IAPB聚體蛋白性質(zhì)的進(jìn)行初步分析后，選擇了以GST融合的方式試驗(yàn)可溶性表達(dá)它的四個(gè)亞基(S2，S3，S4和S5)。通過比對(duì)已報(bào)道的四個(gè)典型株(152us，TohamaI，ptxslD，pt

2、xstrain18323)的基因序列的一致性，設(shè)計(jì)了四對(duì)分別帶有BamHI與XhoI酶切位點(diǎn)的引物。采用套式PCR解決了S2與S3基因同源性的影響，并特異性地?cái)U(kuò)增出了S2與S3的序列。S4、S5基因則由直接擴(kuò)增產(chǎn)生。用凝膠回收試劑盒純化PCR產(chǎn)物后，將酶切片段連接到表達(dá)載體pGEX-6p-1上，并通過測序證實(shí)克隆的序列與已經(jīng)報(bào)道的TohamaI完全一致，完成了IAPB聚體四個(gè)亞基的表達(dá)載體的構(gòu)建工作。 將構(gòu)建的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.