廣西巴馬小型豬活化素β-,A-、β-,B-亞基基因成熟肽序列的克隆及原核表達.pdf

1、活化素(activin，ACT)是轉化生長因子β(TGF-β)超家族成員之一，是由兩個β亞單位通過二硫鍵相連而形成的二聚體可溶性糖蛋白，主要功能是通過活化素(activin，ACT)/抑制素(inhibin，INH)系統，參與下丘腦一垂體一卵巢軸調控來調節(jié)哺乳動物生殖細胞的發(fā)育與成熟。另外，活化素對體內不同組織細胞如肝臟、腎臟及肌肉等還有著廣泛的調節(jié)功能。 本研究參照GenBank發(fā)表的豬活化素β<,A>、β<,B>基因序列，對

2、每個基因分別設計兩對特異性引物，分段擴增，然后拼接。以廣西巴馬小型豬發(fā)情母豬卵巢組織總RNA為模板，通過反向聚合酶鏈式反應(RT-PCR)擴增出相應的cDNA片段。擴增片段純化后，連接到pMD18-T載體，轉入DH5α細菌擴增，并測序。結果表明：擴增得到的activin β<,A>基因序列為1472bp，幾乎包含了整個編碼序列；而擴增得到的activin β<,B>為791 bp，包含整個成熟肽及部分信號肽DNA序列。同源性比較發(fā)現，廣

3、西巴馬小型豬activin β<,A>、β<,B>與GenBank報道的豬activin β<,A>、β<,B>基因序列的同源性分別達到99.8％和99.6％，與奶牛、馬及人等物種activin β<,A>、β<,B>基因序列的同源性也達到了90％以上，說明克隆得到的activin β<,A>、β<,B>基因序列的正確性。測序結果發(fā)現activin β<,A>有5處發(fā)生了單個堿基的突變：即編碼序列的第391位、496位、640位、126

4、7位及3’端調控序列上的一個堿基；activin β<,B>有3個堿基發(fā)生了突變：即編碼序列的第599位、732位及848位。根據activin β<,A>、β<,B>基因成熟肽序列，分別設計兩對引物，并在上下游引物上分別設計BamHl和EcoRI酶切位點，擴增activjn β<,A>、β<,B>基因的成熟肽序列。經BamHl和EcoRl酶切分別將各個成熟肽序列定向連接到原核表達載體pRSETA質粒上，構建ACT-pRSETA融合表達

5、載體，轉化大腸桿菌BL21 CDE3)LysS。ACT-pRSETA重組質粒經鑒定有正確的閱讀框后，進行IPTG誘導表達ACT融合蛋白。經SDS-PAGE和Western Blotting分析，證明已成功地表達了activin β<,A>、β<,B>基因成熟肽序列的融合蛋白(各個片段的大小約為20KD)，此融合蛋白以包涵體的形式表達，有較高的表達量。誘導條件優(yōu)化發(fā)現。37℃下培養(yǎng)，IPTG誘導的濃度為1 mM，誘導5-8h有較好的效果。