肉牛肌生成抑制素成熟蛋白編碼序列的克隆與原核表達.pdf

1、肌生成抑制素是轉化生長因子-β超家族中的一個成員，它是肌肉生長的負調控因子。通過基因打靶技術獲得的肌生成抑制素基因缺失鼠，其骨骼肌的數量呈現出明顯而廣泛的增加，而重量是正常小鼠的2-3倍；MSTN主要在成年動物的骨骼肌中表達，它的缺失及敲除可以使肉牛具有雙肌表型，這種牛的骨骼肌重量較一般品種大20％左右，而脂肪含量較低，肉質性狀優(yōu)良。因此MSTN基因已成為目前畜禽肉質性狀的最主要標記基因。研究MSTN的結構、構建其原核表達載體和功能，目

2、的在于通過MSTN基因的抗體或抑制劑與MSTN基因結合，滅活其功能，安全高效地進行組織細胞營養(yǎng)代謝調控。對于提高肉用動物產肉量和瘦肉率，改善肉的品質，降低飼養(yǎng)成本等具有非常重要的理論意義和實際應用價值。 本研究利用Trizol法，從肉牛的骨骼肌中提取總RNA。RT-PCR法擴增出MSTNcDNA片段，并與pMD-18T載體相連接，轉化E.coliJM109。通過PCR、酶切鑒定及序列分析，篩選陽性克隆。 從MSTNmRN

3、A序列中設計引物上游5'端加BamHⅠ酶切位點和起始密碼子ATG，下游5'端加SalⅠ酶切位點和終止密碼子TTA，TCA。以MSTNcDNA為模板，PCR擴增MSTN成熟蛋白編碼序列，用1％瓊脂糖電泳回收PCR產物。將PCR產物與pMD-18T載體16℃過夜連接，將連接產物轉化入用TSS法制備的感受態(tài)細胞中，將轉化菌涂布在含有X-gal、IPTG和氨芐青霉素(Amp)的LB固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)12～16小時，挑選白色菌落培養(yǎng)，采用堿

4、裂解法提取質粒，經PCR和酶切鑒定，結果表明，以肉牛肌肉細胞總RNA為模板，擴增出的MSTN基因的cDNA序列，產物全長1128bp，編碼375個氨基酸序列。成功地構建了牛pMD18-T-MSTN克隆質粒，測序分析結果與設計一致。 將克隆質粒pMD-18T-MSTN與原核表達載體pET28a(+)同時用TaKaRa公司的回收試劑盒回收牛MSTN目的片段及pET28a(+)載體，在T4DNA連接酶、雙酶切的作用下將目的片段插入原核