支氣管哮喘相關(guān)基因的多態(tài)性研究.pdf

1、支氣管哮喘是一種常見的慢性呼吸系統(tǒng)疾病，在臨床上常表現(xiàn)為反復(fù)發(fā)作的喘息、咳嗽、呼吸困難等，受遺傳因素和環(huán)境因素間復(fù)雜的相互作用而發(fā)病。近幾十年來，隨著工業(yè)化的進(jìn)展和環(huán)境的改變，哮喘發(fā)病率和死亡率在大多數(shù)國家呈上升的趨勢。家系和雙子研究顯示出哮喘發(fā)病有很強(qiáng)的個(gè)體遺傳特質(zhì)。使用定位克隆技術(shù)和候選基因的方法，發(fā)現(xiàn)人類多個(gè)染色體的不同區(qū)域及多個(gè)候選基因與哮喘發(fā)病相關(guān)，其中就有位于人類染色體5q31-33區(qū)的TIM-4基因、IL-4基因、IL-1

2、3基因、CD14基因，位于染色體16p11-12區(qū)的IL-4Rα基因，以及位于12q13-24區(qū)的STAT6基因。研究表明，Th1/Th2細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞因子失衡在哮喘的發(fā)病機(jī)制中起著主要的作用，而哮喘通常被認(rèn)為是一種Th2型疾病。TIM-4基因是新近發(fā)現(xiàn)的TIM基因家族中一員，與TIM-1結(jié)合后可提供一個(gè)協(xié)同刺激信號介導(dǎo)Th2細(xì)胞的增殖與分化。IL-4、IL-13已被認(rèn)為是傳統(tǒng)的哮喘易感基因，國內(nèi)外多篇文獻(xiàn)報(bào)道了關(guān)于其基因多態(tài)性與哮

3、喘的關(guān)聯(lián)性研究，但結(jié)果卻未能得到統(tǒng)一。IL-4Rα基因是IL-4、IL-13基因受體的共同組成部分，STAT6基因是IL-4/IL-13通路執(zhí)行生物學(xué)功能的轉(zhuǎn)錄激活因子，兩者同樣在哮喘的發(fā)病中起著重要的作用。CD14基因位于哮喘易感區(qū)5q31.1，有報(bào)道稱位于啟動(dòng)子區(qū)的-C159T突變與兒童哮喘及成人血清高IgE水平相關(guān)。因?yàn)橄且环N復(fù)雜的多基因性疾病，因此研究多個(gè)基因之間的交互作用對哮喘發(fā)病的影響是十分必要的。雖然上述6個(gè)基因的多態(tài)

4、性位點(diǎn)在一些人群中報(bào)道與哮喘具有相關(guān)性，但其基因間的交互作用與哮喘的關(guān)聯(lián)卻研究甚少，因此我們研究其基因的交互作用對哮喘的影響可能會(huì)對哮喘的發(fā)病機(jī)理帶來新的認(rèn)識。一般來說，在疾病的關(guān)聯(lián)研究中，如果僅僅只使用常規(guī)的病例對照研究可能由于人群分層的影響而帶來假陽性/假陰性結(jié)果，因此，我們采取病例對照和家系對照相結(jié)合的方法，避免這些不利的影響，從而能更加嚴(yán)格地說明其基因多態(tài)性與哮喘的相關(guān)關(guān)系。
　　 本課題我們首先探討了以CRS-RFLP

5、法研究TIM-4基多態(tài)性與支氣管哮喘的相關(guān)關(guān)系，同時(shí)也是基于CRS-RFLP方法學(xué)的建立。然后基于CRS-RFLP的基礎(chǔ)上，使用病例對照研究了IL-4、IL-13、IL-4Rα、STAT6、CD14基因共8個(gè)SNPs的單個(gè)SNP及單倍型與支氣管哮喘的關(guān)系，同時(shí)，運(yùn)用MDR方法來分析其基因交互作用與哮喘的相關(guān)關(guān)系。最后我們使用核心家系資料，利用單個(gè)SNP、單倍型的關(guān)聯(lián)研究，以及基于家系的基因交互作用來探討上述5個(gè)哮喘候選基因的8個(gè)SNPs

6、與中國中部地區(qū)漢族人群支氣管哮喘及血清總IgE的相關(guān)關(guān)系。本研究共分為如下的三個(gè)部分：
　　 第一部分 運(yùn)用CRS-RFLP法研究TIM-4基多態(tài)性與支氣管哮喘的相關(guān)關(guān)系
　　 目的
　　 探討T細(xì)胞免疫球蛋白域粘蛋白域蛋白-4（T cells immunoglobulin domain and mucin domain protein-4，TIM-4）基因外顯子2區(qū)Lys65Lys(G/A)、外顯子3區(qū)Val1

7、72Met(G/A)、外顯子9區(qū)Val365Met(G/A)的單核苷酸多態(tài)性（SNP）與中國中部地區(qū)漢族人群支氣管哮喘及其表型的相關(guān)關(guān)系。
　　 方法
　　 采用創(chuàng)造酶切位點(diǎn)－限制性片段長度多態(tài)性（CRS-RFLP）的方法對中國中部地區(qū)185例哮喘患者和162例健康者TIM-4基因外顯子2區(qū)Lys65Lys(G/A)、外顯子3區(qū)Val172Met(G/A)、外顯子9區(qū)Val365Met(G/A)的多態(tài)性進(jìn)行分析，計(jì)算基因

8、型和等位基因頻率，并比較其在兩組中的差異。采用化學(xué)發(fā)光法測定血清總IgE含量，比較其在哮喘患者各位點(diǎn)不同基因型之間的差異。
　　 結(jié)果
　　 （1）TIM-4基因外顯子2區(qū)Lys65Lys(G/A)位點(diǎn)GG、GA基因型頻率，G、A等位基因頻率在哮喘組和對照組均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），本位點(diǎn)在中國中部地區(qū)漢族人群共347個(gè)標(biāo)本中未檢測到AA基因型。（2）本試驗(yàn)在中國中部地區(qū)漢族人群共347個(gè)標(biāo)本中未檢測到TIM-4外

9、顯子3區(qū)Val172Met(G/A)的多態(tài)性，所有標(biāo)本均為GG型。（3）本試驗(yàn)在中國中部地區(qū)漢族人群共347個(gè)標(biāo)本中未檢測到TIM-4外顯子9區(qū)Val365Met(G/A)的多態(tài)性，所有標(biāo)本均為GG型。（4）哮喘組血清總IgE含量在外顯子2區(qū)Lys65Lys(G/A)位點(diǎn)不同基因型間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)論
　　 TIM-4基因外顯子2區(qū)Lys65Lys(G/A)存在單核苷酸多態(tài)性變異，但該位點(diǎn)的變異與中國中部地區(qū)

10、漢族人群支氣管哮喘易感性及其表型血清總IgE水平無關(guān)；TIM-4基因外顯子3區(qū)Val172Met(G/A)、外顯子9區(qū)Val365Met(G/A)在中國中部地區(qū)漢族人群中未發(fā)現(xiàn)單核苷酸多態(tài)性。
　　 第二部分 IL-4、IL-13、IL-4Rα、STAT6、CD14基因多態(tài)性的單個(gè)SNP及其基因交互作用與支氣管哮喘的相關(guān)性研究
　　 目的
　　 探討IL-4-C33T、IL-4-C589T、IL-13 R130Q

11、、IL-13 C1923T、IL-4RαI75V、IL-4RαQ576R、CD14-C159T、STAT6 C2892T多態(tài)性位點(diǎn)：1）.單個(gè)SNP；2）.IL-4、IL-13、IL-4Rα基因單倍型；3）.上述8個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)的基因交互作用與中國中部地區(qū)漢族兒童哮喘的相關(guān)性。
　　 方法
　　 采用創(chuàng)造酶切位點(diǎn)－限制性片段長度多態(tài)性（CRS-RFLP）的方法對中國中部地區(qū)252例哮喘兒童和227例健康兒童共479名兒童I

12、L-4-C33T、IL-4-C589T、IL-13 R130Q、IL-13 C1923T、IL-4RαI75V、IL-4RαQ576R、CD14-C159T、STAT6 C2892T的多態(tài)性進(jìn)行分析。使用基因計(jì)數(shù)法計(jì)算單個(gè)SNP與哮喘的相關(guān)關(guān)系；使用SHEsis在線軟件對IL-4、IL-13、IL-4Rα基因分別進(jìn)行單倍型分析；使用多因子降維法（MDR）檢測8個(gè)SNPs之間的基因交互作用與哮喘的相關(guān)關(guān)系。
　　 結(jié)果
　　

13、 8個(gè)SNPs中僅IL-13 R130Q和IL-13 C1923T位點(diǎn)的基因型頻率和等位基因頻率在哮喘兒童與健康兒童間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。IL-13 R130Q位點(diǎn)的A等位基因和IL-13 C1923T位點(diǎn)的T等位基因具有較高的哮喘發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)（OR=1.59，95％ CI 1.20-2.09；OR=1.57，95％ CI 1.19-2.08）。其余6個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)的單個(gè)SNP與哮喘無相關(guān)性。通過單倍型分析，由C1923T和R130Q構(gòu)成的I

14、L-13基因單倍型中，CG和TA單倍型與兒童哮喘顯著相關(guān)（P＜0.05）。由I75V和Q576R構(gòu)成的IL-4Rα基因單倍型中，GA和AA單倍型與兒童哮喘具有相關(guān)性（P＜0.05）。由-C33T和-C589T構(gòu)成的IL-4基因單倍型中，未檢測到與哮喘顯著相關(guān)的單倍型。通過MDR分析，我們檢測到由IL-4 ? C33T、IL-13 R130Q、IL-4RαI75V、IL-4RαQ576R、STAT6 C2892T、CD14-C159T 6

15、個(gè)SNPs位點(diǎn)構(gòu)成的最佳基因交互模型，具有潛在的哮喘發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)（OR=4.43，95％ CI 1.30-15.04；P＜0.001，通1000次排列檢驗(yàn)）。
　　 結(jié)論
　　 IL-13基因多態(tài)性單個(gè)SNP及其單倍型與中國中部地區(qū)兒童哮喘的易感性相關(guān)，提示IL-13在哮喘的發(fā)病中起著重要作用。IL-4Rα基因單倍型與哮喘具有關(guān)聯(lián)性，提示IL-4Rα可能以單倍型的形式影響哮喘的易感性。由IL-4 ? C33T、IL-13 R

16、130Q、IL-4RαI75V、IL-4RαQ576R、STAT6 C2892T、CD14-C159T構(gòu)成的基因交互模型可增加中國中部地區(qū)兒童患哮喘的風(fēng)險(xiǎn)性。
　　 第三部分基于家系的IL-4、IL-13、IL-4Rα、STAT6、CD14基因多態(tài)性與支氣管哮喘的易感性研究
　　 目的
　　 基于核心家系資料基礎(chǔ)，探討IL-4-C33T、IL-4-C589T、IL-13 R130Q、IL-13 C1923T、IL

17、-4RαI75V、IL-4RαQ576R、CD14-C159T、STAT6 C2892T各多態(tài)性位點(diǎn)：1）.單個(gè)SNP；2）.IL-4、IL-13、IL-4Rα基因單倍型；3）.上述8個(gè)SNPs位點(diǎn)之間的基因交互作用與中國中部地區(qū)漢族人群支氣管哮喘及其表型的關(guān)系。
　　 方法
　　 采用創(chuàng)造酶切位點(diǎn)－限制性片段長度多態(tài)性（CRS-RFLP）的方法對中國中部地區(qū)126個(gè)核心家系（由一名哮喘患者及其雙親組成）共378名成員I

18、L-4-C33T、IL-4-C589T、IL-13 R130Q、IL-13 C1923T、IL-4RαI75V、IL-4RαQ576R、CD14-C159T、STAT6 C2892T的多態(tài)性進(jìn)行分析。采用化學(xué)發(fā)光法測定血清總IgE含量。采用基于家系的單倍型相對風(fēng)險(xiǎn)分析（HRR）進(jìn)行各單個(gè)SNP與哮喘的傳遞不平衡關(guān)聯(lián)分析。使用FBAT軟件分析單倍型與哮喘之間的關(guān)聯(lián)性，及單個(gè)SNP、單倍型與哮喘表型血清總IgE的相關(guān)性。使用MDR軟件分析上

19、述8個(gè)SNPs位點(diǎn)的基因交互作用與哮喘易感性的關(guān)系。
　　 結(jié)果
　　 經(jīng)單個(gè)SNP與哮喘的HRR分析，各SNP位點(diǎn)與哮喘均無顯著相關(guān)性。經(jīng)FBAT分析，IL-4、IL-13、IL-4Rα各基因單倍型與哮喘均無相關(guān)性。IL-13基因C1923T位點(diǎn)T等位基因和R130Q位點(diǎn)A等位基因與哮喘表型血清總IgE水平相關(guān)（P=0.038， P=0.043）。其中，C1923T的T等位基因和R130Q的A等位基因均具有較高的血清總

20、IgE水平觀察值，是血清高IgE水平的風(fēng)險(xiǎn)因子。由C1923T和R130Q構(gòu)成的IL-13基因單倍型CG及由I75V和Q576R構(gòu)成的IL-4Rα基因單倍型AA與血清總IgE水平相關(guān)（P=0.032，P=0.026）。通過MDR分析，我們檢測到由IL-4 ? C33T、IL-13 R130Q、IL-4RαI75V、IL-4RαQ576R、STAT6 C2892T、CD14-C159T 6個(gè)SNPs位點(diǎn)構(gòu)成的最佳基因交互模型，具有潛在的哮

21、喘發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)（OR=12.08，95％ CI 1.86-78.52；P＜0.001，通1000次排列檢驗(yàn)）。
　　 結(jié)論
　　 IL-13基因多態(tài)性以單個(gè)SNP及單倍型形式影響哮喘相關(guān)表型血清總IgE的水平。IL-4Rα基因多態(tài)性以單倍型的形式影響血清IgE的水平。由IL-4 ? C33T、IL-13 R130Q、IL-4RαI75V、IL-4RαQ576R、STAT6 C2892T、CD14-C159T構(gòu)成的基因交互作用