西柏利亞蓼PsGSTU1、PsCSase1、PsnsLTP基因的抗逆功能分析.pdf

1、本文將對轉(zhuǎn)單價基因煙草(PsGSTU1和PsCSael)和轉(zhuǎn)雙價基因煙草(PsGST+PsCSase)在抗非生物脅迫方面進行研究,同時觀察雙價基因間是否具有協(xié)同性和疊加性:將從西伯利亞蓼中克隆得到的基因PsnsLTP構(gòu)建植物表達載體和酵母表達載體,成功得到了轉(zhuǎn)基因煙草和轉(zhuǎn)基因酵母,并對其進行生物學方面的鑒定,分析了轉(zhuǎn)基因煙草耐生物和非生物脅迫方面的功能,轉(zhuǎn)基因酵母耐非生物脅迫方面的功能,結(jié)果如下:
　　 1、對轉(zhuǎn)PsGST基因、

2、PsCSase基因和雙價基因GC(PsGST+PsCSase)煙草進行如下幾種不同非生物脅迫實驗:種子萌發(fā)實驗(0.9％,1.2％ NaCl；10 mM,20 mM NaHCO3；20％PEG6000；200μM CdCl2；UV-B:90μW/cm2紫外線):組培苗脅迫實驗(0.6％、0.9％、1.2％NaCl；400μM CdCl2):在室溫內(nèi)脅迫條件下的生理生化指標測定實驗(分別對NaCl、CdCl2、PEG6000和紫外線脅迫下

3、煙草SOD、POD、MDA和可溶性蛋白的測定)。無論從種子萌發(fā)比較、組培苗脅迫后表型比較還是脅迫后煙草生理生化指標的測定比較,結(jié)果都顯示轉(zhuǎn)PsGST基因、PsCSase基因和雙價基因GC(PsGST+PsCSase)煙草抗NaCl、NaHCO3、PEG6000、CdCl2和紫外線的能力高于對照,但并沒有表現(xiàn)出雙價基因的協(xié)同性,反而轉(zhuǎn)PsCSase基因煙草耐逆境脅迫能力最高。
　　 2、利用農(nóng)桿菌介導法將外源基因PsnsLTP轉(zhuǎn)入

4、煙草中,經(jīng)PCR和RT-PCR檢測基因已經(jīng)成功轉(zhuǎn)入煙草基因組中并能正常轉(zhuǎn)錄。對轉(zhuǎn)基因煙草進行如下實驗:葉盤耐鹽耐重金屬實驗(3 mM,5 mM CuSO4;200μM,400μM NiCl；100μM,200μM ZnCl2;3mM,8 mM CdSO4；400μM,800μM CdCl2；100μM,200μM AlCl3；1.2％ NaCl；15 mMNaHCO3):種子萌發(fā)實驗(0.9％,1.2％NaCl；10 mM,20 mM

5、NaHCO3；200μM CdCl2；UV-B:90μW/cm2紫外線)；組培苗脅迫實驗(0.6％,1.2％,1.5％NaCl；100μM,200μM CdCl2；7.5％PEG6000)；室溫內(nèi)植株脅迫條件下生理生化指標測定實驗(分別對NaCl、CdCl2、PEG6000和紫外線脅迫下煙草SOD、POD、MDA和可溶性蛋白的測定),所有實驗結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因煙草抗鹽堿、重金屬和紫外線的能力明顯高于對照。
　　 3、對轉(zhuǎn)PsnsLT

6、P基因煙草進行生物脅迫實驗,離體接菌法將煙草炭疽病病菌和猝倒病病菌分別接菌到轉(zhuǎn)基因煙草和對照煙草葉片上,對照煙草葉片出現(xiàn)明顯的炭疽病癥狀,而轉(zhuǎn)基因煙草苗與對照相比癥狀較輕;在猝倒病上,也出現(xiàn)了相似的效果,說明外源基因PsnsLTP轉(zhuǎn)入煙草中提高了其對炭疽病和猝倒病的抗性,初步驗證了該基因在抗病原菌方面的功能。
　　 4、構(gòu)建外源基因PsnsLTP酵母表達載體pYES2-nsLTP,PCR及RT-PCR證明了外源基因己成功轉(zhuǎn)入IN

7、VScl中并能正常轉(zhuǎn)錄,5 M NaCl；1 M NaHCO3,1 M Na2CO3；400μM CdCl2:3 mM,5 mM,8 mM CdSO4和1 mM,3 mM,5 mM CuSO4的脅迫下,隨著脅迫時間及脅迫溶液濃度的增加,轉(zhuǎn)基因酵母存活率始終高于對照,而且差別愈加明顯,說明在半乳糖的誘導下,外源nsLTP基因可以提高轉(zhuǎn)基因酵母INVScl-pYES2-nsLTP抗鹽堿、抗鎘和銅的能力,實驗結(jié)果與轉(zhuǎn)nsLTP基因煙草實驗相吻