亞油酸和聚蘋果酸雙接枝殼聚糖新型納米載體材料及共增強抗腫瘤藥物功效研究.pdf

1、惡性腫瘤是嚴重威脅人類健康的重大疾病,化療藥物對腫瘤細胞的選擇性差,毒副作用大,治療效果不理想。開發(fā)新型給藥系統(tǒng)(Drug DeliverySystem,DDS)提高現(xiàn)有抗腫瘤藥物療效,減少毒副作用,可降低新藥開發(fā)的風險,藥物的安全性也更加可靠,已成為癌癥治療研究的熱點。納米給藥系統(tǒng)由于可緩、控釋藥物及靶向給藥而受到廣泛關注,納米給藥系統(tǒng)的載體材料必須具有良好的安全性才能進一步用于臨床或生產(chǎn)上市。殼聚糖因良好的生物相容性和生物可降解性而

2、獲得廣泛應用,是美國FDA批準的載體材料之一。本研究目的在于開發(fā)一種兩親性殼聚糖衍生物納米粒,并對其進行PEG、葉酸(Folic acid,FA)和生物素(Biotin,BT)功能化修飾,使其成為一種安全、高效、可主動靶向腫瘤組織的抗癌藥物給藥載體。
　　 以酰氯化反應制備亞油酸(LA)和聚蘋果酸(PMLA)雙接枝殼聚糖(LMC),希夫堿反應與EDC·HCl脫水縮合反應制備功能化修飾的LMC衍生物:PEG修飾的LMC(PEG-L

3、MC)、葉酸修飾的PEG-LMC(FA-PEG-LMC)及生物素修飾的PEG-LMC(BT-PEG-LMC);LMC及其衍生物在水中自組裝形成納米粒;以紫杉醇(PTX)為難溶性抗腫瘤模型藥物研究LMC及其衍生物納米粒的理化性質、載藥特點及體外釋藥規(guī)律;以H22荷瘤小鼠為模型,考察載PTXLMC及其衍生物納米粒的抑瘤率;以SMMC-7721為腫瘤細胞模型、HEK-293為正常細胞模型研究LMC及其衍生物納米粒的體外細胞攝取;以正常小鼠和H

4、22荷瘤小鼠為模型,研究LMC及其衍生物納米粒的體內組織分布及靶向性。
　　 1LMC及其功能化修飾衍生物的制備與表征
　　 以D,L-天冬氨酸為起始單體,乳酸為引發(fā)劑,采用內酯開環(huán)聚合法合成一種含乳酸末端的聚蘋果酸芐酯(PMLABz);以甲基磺酸為溶劑,酰氯法活化亞油酸和聚蘋果酸芐酯,使其與殼聚糖的羥基以酯鍵連接或與氨基以酰胺鍵連接,制備LMC?？疾靵営退岷途厶O果酸的投料比、投料順序、反應溫度及反應時間對LMC接枝反應

5、的影響,確定LMC的制備純化工藝:亞油酸與殼聚糖單元摩爾比為0.2～1.0,蘋果酸單體與殼聚糖單元摩爾比為1.0,室溫反應6h,以甲基磺酸脫保護基,利用LMC的pH敏感性純化產(chǎn)物。
　　 DMSO-醋酸酐法制備mPEG醛,考察醋酸酐與mPEG的摩爾比、反應溫度與反應時間對mPEG醛活化率的影響,制得活化率80％以上的mPEG醛。mPEG醛與LMC在DMSO和pH8.0硼酸緩沖液混合溶劑中反應,硼氫化鈉還原,離心純化制得PEG-L

6、MC。
　　 經(jīng)EDC·HC1介導的縮合反應將葉酸和生物素接枝至PEG-LMC上,制得FA-PEG-LMC和BT-PEG-LMC。確定其制備工藝:以EDC·HC1、NHS、DMAP催化反應,透析法純化產(chǎn)物。
　　 采用FTIR、1HNMR、X射線衍射、DSC和元素分析表征了LMC及其衍生物的結構。元素分析結果表明亞油酸的取代度(DS)介于36.1～60.5之間,PMLA的DS介于0.7～1.1之間,PEG、FA和BT的D

7、S分別為12.4,6.0和6.1。
　　 2LMC及其衍生物納米粒的制備、表征及載藥、釋藥特性
　　 以PTX為模型藥物,研究LMC及功能化修飾的LMC衍生物自組裝納米粒作為難溶性抗癌藥物載體的特點。超聲法制各LMC及其衍生物自組裝納米粒;透射電子顯微鏡(TEM)和掃描電子顯微鏡(SEM)考察納米粒的形態(tài),動態(tài)激光光散射法(DLLS)測定納米粒的粒徑與Zeta電勢,穩(wěn)態(tài)熒光探針法測定納米粒的臨界聚集濃度(CAC);制備載

8、PTXLMC及其衍生物納米粒,考察親疏水組分比例與PEG、FA和BT修飾對包封率、載藥量和體外釋放行為的影響。
　　 LMC及其衍生物納米粒在水中的平均粒徑為190～350nm,生理條件下Zeta電勢為-2～20mV。LMC的粒徑隨LA取代度的增加而減小,隨PMLA鏈長的增加而增大,且堿性條件下的粒徑大于酸性條件。LMC納米粒的Zeta電勢受介質pH值影響,pH＜6.0時帶正電,6.0＜pH＜7.0時電荷接近0,pH＞7.0時帶

9、負電。PEG修飾增大LMC納米粒的粒徑,且可屏蔽納米粒表面電荷,使其Zeta電勢絕對值降低。FA和BT修飾對PEG-LMC的粒徑和Zeta電勢無明顯影響。LMC的CAC隨LA取代度的增加而減小,PEG、FA和BT修飾不明顯改變CAC。LMC及其衍生物納米粒對PTX的包封率均超過70％,最高可達90％;載藥量隨LA取代度的增加而增加,最高可達9.9％,PEG修飾使載藥量略有降低。載PTXLMC納米粒4h的累積釋放率約為50～60％,8h的

10、累積釋放率約為70～80％,可持續(xù)釋放藥物達24h。LA取代度較大、PMLA鏈較長的LMC納米粒釋藥速度較慢,PEG修飾可增強LMC納米粒的緩釋能力。
　　 3載紫杉醇納米粒的抗腫瘤作用、體內外靶向性及安全性
　　 考察載PTXLMC及其衍生物納米粒對H22荷瘤小鼠的抑瘤效果,結果抑瘤率強弱順序為:FA-PEG-LMC＞BT-PEG-LMC＞PEG-LMC＞LMC＞PTX溶液,其中FA-PEG-LMC與BT-PEG-LM

11、C的抑瘤率分別為82.5％和80.6％,可有效抑制H22腫瘤的生長。
　　 細胞攝取試驗考察LMC及其衍生物納米粒的體外腫瘤細胞靶向性。制備羅丹明B標記的LMC納米粒(RB-LMCNP)、PEG-LMC納米粒(RB-PEG-LMCNP)、葉酸修飾的LMC納米粒(RB-FA-LMCNP)、葉酸修飾的PEG-LMC納米粒(RB-FA-PEG-LMCNP)、生物素修飾的LMC納米粒(RB-BT-LMCNP)和生物素修飾的PEG-LMC

12、納米粒(RB-BT-PEG-LMCNP),考察其在SMMC-7721細胞和HEK-293細胞中的攝取。結果表明SMMC-7721腫瘤細胞對LMC及其衍生物納米粒的攝取能力強于HEK-293正常細胞;納米粒濃度低于1000μg·mL-1時,SMMC-7721細胞對納米粒的攝取量隨納米粒濃度的增加而增加;納米粒濃度低于500μg·mL-1時,HEK-293細胞對納米粒的攝取量隨納米粒濃度的增加而增加;4h內,SMMC-7721和HEK-29

13、3細胞對納米粒的攝取量隨共培育時間的延長而增加。FA和BT修飾的LMC納米粒在SMMC-7721細胞中的攝取量顯著高于LMC納米粒(FA-LMC和BT-LMC的攝取量分別為LMC的3～5倍和2～3倍),在HEK-293正常細胞中的攝取量顯著低于SMMC-7721腫瘤細胞,表明FA和BT修飾的LMC納米?？蛇x擇性地主動靶向腫瘤細胞。PEG修飾對LMC納米粒的攝取無明顯影響,但同時修飾配體和PEG的FA-PEG-LMC和BT-PEG-LMC

14、的細胞攝取量低于FA-LMC和BT-LMC。游離葉酸及生物素可抑制相應FA和BT修飾的納米粒的攝取,對FA-PEG-LMC和BT-PEG-LMC納米粒的抑制率高于FA-LMC和BT-LMC,表明FA-LMC和BT-LMC對細胞表面葉酸和生物素受體親和力更強。
　　 以正常小鼠和荷H22腫瘤小鼠為模型,考察載PTX的LMC納米粒、PEG-LMC納米粒、FA-PEG-LMC納米粒與BT-PEG-LMC納米粒的體內組織分布和腫瘤靶向性

15、。HPLC測定體內藥物濃度,方法專屬性、精密度、回收率均較好。PEG-LMC組血液中藥物濃度時間曲線下面積(AUC)為LMC組的3.05倍,肝中AUC為LMC組的61％,脾中AUC與LMC組相近,表明PEG修飾可顯著延長納米粒在血液中的循環(huán)時間,減少肝巨噬細胞的吞噬,但無法避免脾巨噬細胞的吞噬;LMC、PEG-LMC、FA-PEG-LMC與BT-PEG-LMC納米粒均具有一定的腫瘤靶向性,腫瘤相對攝取率(Re)分別為1.36、2.51、