孢子絲菌病的流行病學(xué)、致病菌的分類鑒定、表型特征及對(duì)中西藥物的敏感性研究.pdf

1、第一部分大連地區(qū)205例孢子絲菌病的流行病學(xué)調(diào)查
　　 目的:對(duì)大連地區(qū)的205例孢子絲菌病進(jìn)行總結(jié)，分析其流行病學(xué)特征。
　　 方法:回顧性分析1998年至2011年就診于大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，并確診為孢子絲菌病患者的臨床資料。
　　 結(jié)果:大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院近14年來孢子絲菌病的患者人數(shù)每年大約15例，未見大幅增長(zhǎng)，發(fā)病趨勢(shì)平穩(wěn)。女性發(fā)病率略高，男女發(fā)病比率為1∶1.14。發(fā)病年齡最小為3歲，最大為

2、83歲，40～69歲的中老年人為主體(74.7％)，兒童也占一定比例(10.7％)。冬春季節(jié)是孢子絲菌病的高發(fā)季節(jié)。多數(shù)有外傷史(62.4％)。臨床分型以固定型最常見占51.2％，其次是淋巴管型占37.6％，有1例皮膚播散型不伴有免疫缺陷和基礎(chǔ)疾病。發(fā)病部位以上肢為主(47.8％)，其次是面部(37.1％)。固定型多發(fā)生在面部和上肢，淋巴管型多發(fā)生在上肢，播散型表現(xiàn)為全身感染。面部皮損中固定型的比例(69.7％)高于四肢皮損中固定型的比

3、例(44.1％)，由此可見面部相對(duì)于四肢更易發(fā)生固定型皮損?；颊咧饕獊碜源筮B周邊地區(qū)的農(nóng)村，以莊河、普蘭店、瓦房店為高發(fā)地區(qū)。
　　 結(jié)論:相對(duì)于吉林地區(qū)近幾年的小范圍流行，大連地區(qū)孢子絲菌病發(fā)病趨勢(shì)平穩(wěn)，屬于散發(fā)病例。流行病學(xué)特征與國(guó)內(nèi)其他報(bào)道相似。報(bào)道1例無免疫異常的皮膚播散型孢子絲菌病。
　　 第二部分我國(guó)東北地區(qū)孢子絲菌的分類鑒定與種系發(fā)生特征的研究
　　 目的:對(duì)我國(guó)東北地區(qū)孢子絲菌病的臨床分離株進(jìn)行分

4、子鑒定和種系發(fā)生分析，了解孢子絲菌復(fù)合體在我國(guó)占優(yōu)勢(shì)的種類;不同的臨床類型的分離株屬于同種還是異種;吉林地區(qū)的流行病例和黑龍江、大連的散發(fā)病例的臨床分離株屬于同種還是異種。
　　 方法:通過大體菌落特點(diǎn)、顯微鏡下分生孢子特點(diǎn)和溫度雙相性進(jìn)行形態(tài)學(xué)初步鑒定;以鈣調(diào)蛋白基因序列為位點(diǎn)，通過測(cè)序的方法對(duì)74株臨床分離株進(jìn)行分子鑒定;在此基礎(chǔ)，再用Neighbor-Joining分析法將上述74株和16株文獻(xiàn)報(bào)道的各個(gè)種共同建立孢子絲菌

5、種系發(fā)生樹。
　　 結(jié)果:所有分離株經(jīng)大體菌落特點(diǎn)、顯微鏡下呈花瓣樣的分生孢子、溫度雙相性轉(zhuǎn)變，形態(tài)學(xué)鑒定為傳統(tǒng)意義上的申克氏孢子絲菌。然后對(duì)部分鈣調(diào)蛋白(CAL)基因片段進(jìn)行測(cè)序并在Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)上比對(duì)，與文獻(xiàn)中已經(jīng)報(bào)道的球形孢子絲菌的模式株AM116908具有99％的相似性，與球形孢子絲菌的模式株AM490354具有100％的相似性，而與申克氏孢子絲菌的模式株AM117437的相似性僅為88％。用Neighbor-Jo

6、ining分析法基于位點(diǎn)CAL序列對(duì)74株臨床分離株和16株文獻(xiàn)報(bào)道的各個(gè)種建立孢子絲菌種系發(fā)生樹，結(jié)果顯示6個(gè)明確的組，即6個(gè)孢子絲菌的種。本研究中來自于中國(guó)東北地區(qū)的所有臨床分離株均與已報(bào)道的球形孢子絲菌（AM116908.1和AM399018）聚為一類。而且，球形孢子絲菌又被進(jìn)一步分成2個(gè)亞組:68株臨床分離株與AM116908.1聚為一個(gè)亞組，而且與文獻(xiàn)報(bào)道的我國(guó)環(huán)境分離株在同一個(gè)亞組。剩下的6株分離株與AM399018聚為另一

7、個(gè)亞組。
　　 結(jié)論:
　　 (1)本研究第一次對(duì)中國(guó)的孢子絲菌臨床株進(jìn)行種系發(fā)生分析，球形孢子絲菌是目前中國(guó)東北地區(qū)主要的致病菌種。
　　 (2)孢子絲菌病臨床形式與孢子絲菌的種系發(fā)生的種無明確相關(guān)性。
　　 (3)吉林省小范圍流行由球形孢子絲菌引起。
　　 (4)在種系發(fā)生上，球形孢子絲菌可進(jìn)一步分成2個(gè)亞組。
　　 第三部分我國(guó)球形孢子絲菌的表型特征、體外對(duì)中西藥物的敏感性研究

8、>　　 目的:對(duì)我國(guó)的球形孢子絲菌進(jìn)行表型特征分析，以便日后在真菌化驗(yàn)室可常規(guī)開展相關(guān)的檢查，迅速鑒定到種。同時(shí)了解球形孢子絲菌體外對(duì)抗真菌藥物的敏感性，并探索具有抗孢子絲菌活性的中藥單體，為臨床提供新的輔助治療措施。
　　 方法:
　　 (1)將菌株接種在不同的平皿培養(yǎng)基中[燕麥培養(yǎng)基(OA)、玉米粉瓊脂培養(yǎng)基(CMA)、馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基(PDA)、沙氏瓊脂培養(yǎng)基(SDA)]，接種后將培養(yǎng)皿放在30℃溫箱暗處培養(yǎng)21

9、天，比較菌落在不同培養(yǎng)基上形態(tài)變化及生長(zhǎng)速度。
　　 (2)玻片小培養(yǎng)(CMA)30℃培養(yǎng)10天，光鏡下觀察分生孢子特點(diǎn)。
　　 (3)溫度試驗(yàn):將菌株接種于PDA培養(yǎng)皿，分別置于30℃、35℃、37℃溫箱中暗處培養(yǎng)21天，觀察菌落直徑。
　　 (4)對(duì)葡萄糖，蔗糖和棉子糖進(jìn)行碳源同化試驗(yàn)，試驗(yàn)在96孔板進(jìn)行。
　　 (5)檢測(cè)74株孢子絲菌對(duì)特比萘芬、伊曲康唑、兩性霉素B、卡泊芬凈的體外敏感性，藥敏試驗(yàn)

10、采用微量液基稀釋法，參照美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)研究所(CLSI)頒布的M38-A2方案，選用孢子絲菌的菌絲相進(jìn)行操作。
　　 (6)應(yīng)用上述方法探索3種中藥單體（丁香酚、檸檬醛、肉桂醛）對(duì)孢子絲菌的抗真菌活性。
　　 結(jié)果:
　　 (1)所有的菌株在4種培養(yǎng)基中的宏觀形態(tài)都是相似的，菌落表面均有皺褶，邊緣有短絨毛。菌落表面產(chǎn)出的黑色素:燕麥培養(yǎng)基＞玉米培養(yǎng)基＞土豆培養(yǎng)基＞沙氏培養(yǎng)基。
　　 (2)CMA培養(yǎng)

11、基30℃培養(yǎng)10天后，顯微鏡下不僅見到呈花瓣?duì)罘植嫉陌胪该鞯穆褕A形的分生孢子，還可見到厚壁的深棕色分生孢子，呈球形或近球形，典型呈套袖狀分布。
　　 (3)所有菌株的最佳生長(zhǎng)溫度是30℃。在PDA上30℃暗處孵育21天后，菌落直徑達(dá)25～45mm，平均直徑是34mm。在PDA上35℃暗處孵育21天后，菌落直徑達(dá)12～15mm，平均直徑是13mm。在PDA上37℃暗處孵育21天后，大多數(shù)菌株顯示限制性生長(zhǎng)，直徑平均9mm，有3株例

12、外，不能在37℃生長(zhǎng)。
　　 (4)碳源同化試驗(yàn):所有的菌株都能同化葡萄糖和蔗糖，不能同化棉子糖。
　　 (5)對(duì)孢子絲菌的菌絲相，特比萘芬表現(xiàn)出最好的體外抗真菌活性，MIC值為0.06～0.5μg/ml，GM值為0.1866μg/ml;其次是兩性霉素B，MIC值為2～8μg/ml，GM值為4.8252μg/ml;伊曲康唑和卡泊芬凈的MIC值均較高。每種抗真菌藥對(duì)不同臨床類型的球形孢子絲菌的MIC值之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

13、r>　　 (6)中藥單體（丁香酚、檸檬醛、肉桂醛）對(duì)30株球形孢子絲菌的MIC值的幾何均值分別是709.1481μg/ml，509.0566μg/ml，437.8494μg/ml，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示，檸檬醛和肉桂醛的抗孢子絲菌活性明顯強(qiáng)于丁香酚。
　　 結(jié)論:
　　 (1)球形孢子絲菌能產(chǎn)生球形或近球形的著色分生孢子，在PDA上30℃孵育21天菌落直徑小于50mm。
　　 (2)球形孢子絲菌能同化蔗糖，不能同化棉子