海洋蠟樣芽孢桿菌Y2 Quorum Quenching N-乙酰高絲氨酸內(nèi)酯酶克隆及其蛋白結(jié)構(gòu)與功能研究.pdf

1、本研究旨在細(xì)菌通過監(jiān)控某些信號(hào)分子的濃度可感知其群體大小，進(jìn)而調(diào)節(jié)整個(gè)群體的行為，使其能與多細(xì)胞生物一樣，行使單個(gè)細(xì)胞無法完成的功能，這種依賴細(xì)胞密度的細(xì)胞信息交流現(xiàn)象被稱為細(xì)菌群體感知系統(tǒng)(quorumsensing，簡(jiǎn)稱QS)。而抗細(xì)菌群體感知系統(tǒng)被稱為細(xì)菌群感淬滅(quorumquenching)。細(xì)菌的多種重要的生理生化功能及其表型特征都與QS系統(tǒng)介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)。由于QS系統(tǒng)參與了多種病原細(xì)菌致病性的產(chǎn)生，因此在發(fā)展抗細(xì)菌感

2、染新療法的研究中，該系統(tǒng)被認(rèn)為是一個(gè)重要的作用靶點(diǎn)。N-乙酰高絲氨酸內(nèi)酯(N-acyl-homoserinelactones，AHLs)，又稱自誘導(dǎo)物(autoinducers，AIs)，是一類調(diào)控大多數(shù)革蘭氏陰性菌QS系統(tǒng)的信號(hào)分子。目前已在多種細(xì)菌和真核生物中發(fā)現(xiàn)了可降解AHLs信號(hào)分子的酶，如N-乙酰高絲氨酸內(nèi)酯酶(AHL-lactonases)，又稱自誘導(dǎo)物失活劑(autoinducerinactivation，AiiAs)，這

3、類酶極具醫(yī)療應(yīng)用潛力，分離和發(fā)現(xiàn)新的QS系統(tǒng)抑制生物和酶十分有利于新型抗生素和生物防控制劑的開發(fā)。 本研究建立了一種QS系統(tǒng)抑制活性菌的平板篩選模型，該模型以根癌農(nóng)桿菌R10和WCF47為指示菌，通過觀察指示菌WCF47對(duì)待測(cè)菌與AHLs(R10粗提物)共培養(yǎng)物的顏色反應(yīng)判斷待測(cè)菌有無AHLs降解活性，具有簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)、直觀的特點(diǎn)。 目前已有報(bào)道的QS系統(tǒng)抑制生物都分離自土壤、植物等陸地生長(zhǎng)環(huán)境，而群體感應(yīng)現(xiàn)象最初是在海洋

4、發(fā)光細(xì)菌Vibrioficheri中首次發(fā)現(xiàn)的，但至今鮮見海洋細(xì)菌QS抑制現(xiàn)象的報(bào)道。本研究分別從海南陵水縣海域和深圳大亞灣海域的不同采樣點(diǎn)采集海水樣品，有限稀釋法涂布平板分離細(xì)菌，通過三次劃線純化分離到的菌株，并應(yīng)用已建立的QS抑制生物檢測(cè)模型篩選其中具有AiiA活性的海洋細(xì)菌。其中，菌株Y2具有明顯和穩(wěn)定的AHLs降解活性。對(duì)Y2進(jìn)行形態(tài)學(xué)、生理生化鑒定及16srDNA序列分析，鑒定該海洋細(xì)菌應(yīng)歸類于真細(xì)菌目、芽孢桿菌科(Bacil

5、laceae)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、蠟樣芽孢桿菌(B.cereus)，暫命名為BacilluscereusY2。 本研究用限制性內(nèi)切酶Sau3AI消化BacilluscereusY2菌株的基因組DNA，并與經(jīng)BamHI酶切的pBACe3.6質(zhì)粒連接，構(gòu)建了BacilluscereusY2的基因組文庫。根據(jù)已知aiiA基因的保守區(qū)域序列設(shè)計(jì)一對(duì)探針，對(duì)BacilluscereusY2的基因組文庫進(jìn)行southernbl

6、otting分析，結(jié)果顯示該海洋細(xì)菌的基因組文庫中存在aiiA基因的同源保守片段。進(jìn)一步利用與aiiA基因5'和3'末端互補(bǔ)的簡(jiǎn)并引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增出海洋細(xì)菌Y2內(nèi)編碼N-乙酰高絲氨酸內(nèi)酯酶的基因Y2-aiiA的全長(zhǎng)序列，并將其克隆入pBV220質(zhì)粒，獲得重組質(zhì)粒pBV220-Y2-aiiA。通過同源比對(duì)發(fā)現(xiàn)Y2-aiiA為一新基因，但與GenBank數(shù)據(jù)庫中其它同類基因有高度的同源性；以重組質(zhì)粒pBV220-Y2-aiiA為PC

7、R模板，將Y2-aiiA基因克隆入原核表達(dá)質(zhì)粒pQE40，獲得重組質(zhì)粒pQE40-Y2-aiiA，將其轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌M15，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)Y2-AiiA的重組表達(dá)，并利用鎳離子螯合層析技術(shù)對(duì)帶有N-端6×His標(biāo)簽的Y2-AiiA蛋白進(jìn)行了純化，得到一分子量約為28kDa并具有AiiA活性的蛋白表達(dá)產(chǎn)物。 為深入了解該來源于海洋的N-乙酰高絲氨酸內(nèi)酯酶的結(jié)構(gòu)和功能特點(diǎn)，利用同源建模的方法建立了Y2-AiiA蛋白的3D結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)該

8、蛋白由5個(gè)α-螺旋和12個(gè)β-折疊構(gòu)成，屬αβ/βα型蛋白超家族；β-折疊形成該蛋白內(nèi)部排列緊密的核心，α-螺旋包圍著由β-折疊形成的蛋白核心，構(gòu)成蛋白外部可溶性的片層結(jié)構(gòu)。在此三維結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，進(jìn)行Y2-AiiA酶蛋白與AHL底物的Docking分子對(duì)接模擬和酶活性位點(diǎn)的預(yù)測(cè)，多次計(jì)算確定的Docking模型提示，Asp17、Ser19和Ser20這三個(gè)保守的氨基酸殘基在Y2-AiiA蛋白的三維結(jié)構(gòu)中占據(jù)了催化部位，Tyr194對(duì)維持

9、Y2-AiiA的三維結(jié)構(gòu)起重要作用，Ser19和Ser20與AHL底物分子之間的作用距離十分有利于酶對(duì)AHL分子結(jié)構(gòu)中高絲氨酸內(nèi)酯環(huán)上的骨架或羰基氧原子的攻擊，或產(chǎn)生穩(wěn)定的酶-底物復(fù)合物。為驗(yàn)證以上結(jié)構(gòu)和功能推測(cè)，對(duì)Y2-AiiA中的的Asp17、Ser19和Ser20這三個(gè)保守氨基酸殘基進(jìn)行了點(diǎn)突變，分別將Asp17突變?yōu)锳sn，將Ser19和Ser20突變?yōu)锳la，并進(jìn)行了野生型和3個(gè)突變型Y2-AiiA蛋白的重組表達(dá)和純化。對(duì)比3

10、種突變型Y2-AiiA蛋白與野生型Y2-AiiA蛋白降解AHL分子的活力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在大腸桿菌中表達(dá)的野生型Y2-AiiA蛋白有較高的AHL降解活性，而Ser19突變導(dǎo)致了酶活力的顯著下降，Ser20突變對(duì)酶活力稍有影響，而Asp17突變對(duì)酶活力無明顯影響，從而最終確定Ser19、Ser20為海洋N-乙酰高絲氨酸內(nèi)酯酶Y2-AiiA的關(guān)鍵催化殘基。基于以上實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，本文對(duì)海洋N-乙酰高絲氨酸內(nèi)酯酶Y2-AiiA的催化機(jī)制作出了推斷，其反