酸敏感離子通道與炎性痛中樞敏化機制的研究.pdf

1、外周炎癥和組織損傷都能導(dǎo)致病理痛的產(chǎn)生。作為傷害性信號傳遞的中樞第一站，脊髓是傷害性信息傳遞和調(diào)控的重要部位。已有的報道表明，脊髓的中樞敏化是病理痛形成的主要機制之一；然而，人們對這種敏化的機制卻了解甚少。在炎性或神經(jīng)病理性疼痛狀態(tài)下，痛覺過敏產(chǎn)生的重要原因之一是由于脊髓背角神經(jīng)元表達(dá)的離子通道和受體受到調(diào)控，從而使其持續(xù)過度興奮。目前，有多種離子通道和受體被認(rèn)為和疼痛的產(chǎn)生與維持相關(guān)。 酸敏感離子通道是一類由質(zhì)子(H<'+>)

2、激活的陽離子通道，屬于ENaC/DEG家族，有四個編碼的基因：ASIC1、ASIC2、ASIC3、ASIC4。它們編碼六種亞基蛋白：ASIC1a、ASIC1b、ASIC2a、ASIC2b、ASIC3和ASIC4。酸敏感離子通道的N-端和 C-端均在胞內(nèi)，有兩個跨膜區(qū)，胞外環(huán)上富含半胱氨酸。最新的結(jié)構(gòu)生物學(xué)實驗發(fā)現(xiàn)，體內(nèi)的ASICs是由相同的或不同的亞基構(gòu)成的三聚體。除了ASIC3和ASIC1b只在外周神經(jīng)系統(tǒng)中特異表達(dá)外，ASICs其他

3、亞基在外周和中樞神經(jīng)系統(tǒng)都有存在。日前對 ASICs 的大部分研究主要集中在外周神經(jīng)系統(tǒng)中，認(rèn)為ASICs參與了痛覺、味覺以及機械感覺等的信息傳遞；而對中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的ASICs功能了解較少，尤其是對病理條件下ASICs的變化如何了解不多。 因此，在本課題中，首先證明了脊髓背角神經(jīng)元中主要表達(dá)Ca<'2+>通透性的ASIC1a通道。進(jìn)一步，探討了ASIC1a通道參與脊髓水平痛覺傳遞和調(diào)制的作用及其機制。主要實驗結(jié)果如下：

4、 1．脊髓背角神經(jīng)元中酸敏感離子通道特性研究運用電生理的方法，我們首先發(fā)現(xiàn)，對于急性分離的脊髓背角神經(jīng)元， Psalmotoxin 1，一種特異的ASIC1a同聚體通道抑制劑，能夠非常明顯的抑制酸性溶液引發(fā)的內(nèi)向電流。采用 RNA 干擾的手段，我們特異的抑制培養(yǎng)的脊髓背角神經(jīng)元中 ASIC1a 的表達(dá)，隨后的電生理實驗發(fā)現(xiàn)，酸性溶液引發(fā)的內(nèi)向電流也明顯的降低。這提示ASIC1a同聚體通道是脊髓背角神經(jīng)元中主要的質(zhì)子感受器。進(jìn)一步的鈣離子

5、成像實驗表明，在脊髓背角神經(jīng)元中，ASIC1a 同聚體通道介導(dǎo)了酸性溶液引起的 Ca<'2+> 內(nèi)流。 2．脊髓背角酸敏感離子通道與炎性痛覺超敏運用完全弗氏佐劑(CFA)致炎模型，我們進(jìn)一步研究了ASIC1a通道在炎癥痛中的作用。行為學(xué)實驗表明，大鼠腳底 CFA 致炎能夠?qū)е旅黠@的熱和機械超敏化，這種行為超敏化能夠持續(xù)超過七天。然而，鞘內(nèi)注射PcTX1能夠明顯地削弱這種外周炎癥引起的熱和機械超敏化。同時，鞘內(nèi)注射阿米洛利(ami

6、loride)，一種非特異性的ASICs抑制劑，也產(chǎn)生同樣的效果。進(jìn)一步，我們使用一條特異性的抑制 ASIC1a 蛋白表達(dá)的反義寡核苷酸發(fā)現(xiàn)，與急性抑制ASIC1a功能相似，在抑制脊髓背角ASIC1a蛋白表達(dá)之后，外周炎癥引起的熱和機械超敏化也被明顯削弱。與之相反的是，鞘內(nèi)注射PcTX1并不影響正常大鼠的傷害性信號傳遞。 為了進(jìn)一步證明脊髓背角的ASIC1a通道參與炎性痛覺超敏，我們采用福爾馬林模型闡明脊髓背角和背根神經(jīng)節(jié)中的A

7、SIC1a通道的功能異同。給大鼠腳背注射福爾馬林能夠使其產(chǎn)生持續(xù)約一小時的傷害性反應(yīng)。根掘持續(xù)時間，這種反應(yīng)被分為兩相：第一相僅與背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞超興奮相關(guān)；第二相與脊髓背角神經(jīng)元超興奮關(guān)系密切。我們的實驗表明，鞘內(nèi)注射PcTX1僅抑制第二相持續(xù)反應(yīng)，而不影響第一相反應(yīng)。相反地，腳底注射PcTX1對傷害性傳遞沒有作用。結(jié)合這兩個實驗，我們進(jìn)一步證明脊髓背角 ASIC1a 通道參與傷害性信號傳遞。 3．脊髓背角酸敏感離子通道影響脊髓

8、背角神經(jīng)元的興奮性和可塑性脊髓背角ASIC1a通道是如何參與傷害性信號傳遞的呢? 免疫組織化學(xué)實驗表明，在外周致炎后，脊髓背角神經(jīng)元中ASIC1a 的蛋白表達(dá)量明顯增加。與之相反，ASIC1a在背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的中樞端和膠質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)卻很少。進(jìn)一步的在體電生理實驗表明，電刺激大鼠足底神經(jīng)激動C-纖維時，脊髓背角廣動力域 (WDR) 神經(jīng)元的興奮性改變，其表現(xiàn)形式為自發(fā)放電增強(“wind-up”現(xiàn)象)。而在脊髓急性給予 PcTX1 能構(gòu)

9、有效的抑制“wind-up”現(xiàn)象。隨后，向WDR 神經(jīng)元的外周感受野中心部位分別施加不同強度的刷 (brushing)、壓(pressing)和夾 (pinching) 等機械性刺激；而在外周致炎的條件下，WDR神經(jīng)元對不同強度brushing、pressing和pinching等機械性刺激反應(yīng)性明顯增強，說明有機械性痛敏產(chǎn)生。進(jìn)一步的實驗表明，脊髓急性給予 PcTX1，并不影響正常大鼠脊髓背角WDR神經(jīng)元對機械性刺激的反應(yīng)。然而，脊髓

10、急性給予 PcTX1能夠明顯抑制致炎大鼠的 WDR 神經(jīng)元對傷害性機械刺激 (包括 pressing 和pinching) 的反應(yīng)性，而對非傷害性機械刺激 (brushing) 引起的反應(yīng)沒有作用。 4．炎性痛中脊髓背角酸敏感離子通道上調(diào)機制初探在炎癥過程中，大量的神經(jīng)遞質(zhì)(Glu)和調(diào)質(zhì)[P物質(zhì)(SP)、BDNF]等從DRG細(xì)胞突觸終術(shù)釋放，影響脊髓背角的突觸傳遞。我們發(fā)現(xiàn)，慢性施加 BDNF 能夠濃度依賴性的增加培養(yǎng)的脊髓背角神經(jīng)元

11、中 ASIC1a 表達(dá)。進(jìn)一步，給大鼠鞘內(nèi)長期注射 BDNF 受體—TrkB 的抑制劑 K252a，能夠抑制外周炎癥引起的脊髓背角ASIC1a的增加和痛行為。而且，在K252a慢性處理的大鼠脊髓中注射 PcTX1，不能進(jìn)一步的抑制痛行為。這提示我們可能是BDNF介導(dǎo)了炎性痛中 ASIC1a 的上調(diào)。另外，穿孔膜片鉗實驗表明，PT3K信號通路，而不是PKA 和CaMKⅡ信號通路，介導(dǎo)了BDNF引起的ASIC1a上調(diào)。 本文鑒定了C