纖維堆囊菌So9733-1木聚糖酶基因的克隆、表征與異源表達分析.pdf

1、本研究擬直接從基因水平出發(fā)，利用基因克隆、分析和表達等方法手段研究酶組分的相關性質(zhì)，以有效解決在酶學研究中遇到的阻力，為進一步了解纖維堆囊菌纖維素酶組分的組織結構方式和纖維素降解機制奠定基礎。 首先對實驗室分離得到的部分纖維堆囊菌菌株進行了初步的纖維素酶酶活(CMC酶、葡萄糖苷酶、木聚糖酶等)測定分析，證明纖維素降解特性在實驗室分離得到的纖維堆囊菌中普遍存在，但不同菌株表現(xiàn)出不同的纖維素降解能力，不同菌株中各種纖維素酶組分的活

2、力比例也存在差異。 根據(jù)上述結果和實驗室前期工作基礎，選定纖維堆囊菌(S,cellulosum)菌株So9733-1作為纖維堆囊菌纖維素降解相關酶系研究的模式菌株，以酶活性普遍較高的木聚糖酶為分析靶標，進行So9733-1木聚糖酶基因的克隆、分析和表達研究。設計和收集了10條不同的引物對對So9733-1基因組DNA進行PCR擴增，經(jīng)片段純化、克隆和測序分析發(fā)現(xiàn)，GH10-F/GH10-R引物對擴增出的一個長度為422bp的片

3、段，經(jīng)BLAST比對分析顯示該片段為木聚糖酶基因片斷，屬于糖苷水解酶F/10家族。利用GH10-F/GH10-R引物對還在其他纖維堆囊菌菌株中獲得了不同長度和氨基酸組成的木聚糖酶基因片斷，表明木聚糖酶基因在堆囊菌中的普遍存在性和多樣性。這一結果與酶活測定中顯示的結果較吻合。利用獲得的木聚糖酶氨基酸片斷與其他微生物來源的木聚糖酶片斷重建系統(tǒng)演化關系，結果表明來源于纖維堆囊菌的木聚糖酶片斷在Neighbor-joining系統(tǒng)進化樹上處于相

4、對獨立的分支，可能屬于新型的木聚糖酶。 以試驗篩選的合適的限制性內(nèi)切酶SalⅠ消化纖維堆囊菌So9733-1基因組DNA，以So9733-1中獲得的422bp木聚糖酶基因片段為探針，結合Southern雜交，建立了含有陽性雜交片段的亞克隆文庫，經(jīng)對文庫克隆子的質(zhì)粒提取和斑點雜交逐級篩選，得到了4個陽性克隆子，經(jīng)測序分析獲得了兩個完整的木聚糖酶基因，定名為xynA、xynB。生物信息學分析表明，xynA、xynB的開放閱讀框(O

5、RF)大小分別為1302bp、1197bp，編碼433aa、398aa的多肽鏈。同GenBank數(shù)據(jù)庫比對分析得知氨基酸序列相似性分別為60％、70％。 采用亞克隆技術，設計帶有NdeⅠ和XhoⅠ酶切位點的PCR引物分別擴增出xynA和xynB兩個木聚糖酶基因的ORF區(qū)，以pET-22b(+)作為表達載體，NdeⅠ、XhoⅠ雙酶切后連接轉化受體菌E.coliBL21(DE3)中表達木聚糖酶基因，分別獲得了陽性重組表達子BL-p

6、ET-xynA、BL-pET-xynB，分析表明BL-pET-xynA、BL-pET-xynB誘導表達產(chǎn)物均為包涵體形式，經(jīng)尿素梯度透析方法復性后，均具有木聚糖酶活性，其中BL-pET-xynA酶活性較低，不適合進行后續(xù)酶學性質(zhì)分析，有待于進行進一步的研究。而對復性純化后的BL-pET-xynB表達產(chǎn)物進行初步的酶學性質(zhì)分析表明，該木聚糖酶的Km值為1.2mg/ml，最適反應溫度為45℃左右，最適pH為6.5左右。酶對溫度穩(wěn)定性較差，5