Sorangium cellulosum So0157-2木聚糖酶的細(xì)胞分布及Xyn11C的異源表達(dá)、性質(zhì)研究.pdf

1、S cellulosum So0157-2中含豐富的木聚糖降解酶系，至少含有5個GH11家族的木聚糖酶，同時還具有GH8、GH10、GH43及GH52家族的木聚糖酶。實驗室前期克隆表達(dá)表征了Xyn11A和Xyn11B，結(jié)果顯示雖然同為11家族的木聚糖酶，Xyn11A為典型內(nèi)切酶，Xyn11B降解木聚糖僅產(chǎn)生木二糖，各具獨特的性質(zhì)。本研究進(jìn)一步針對So0157-2中木聚糖酶基因xyn11C構(gòu)建了表達(dá)載體pET-30a(+)-xyn11C。

2、重組蛋白rXyn11C在E.coli BL21(DE3)中以可溶和包涵體兩種形式表達(dá)，但可溶表達(dá)的蛋白量很低。因此對包涵體蛋白進(jìn)行了Ni-親和層析和透析復(fù)性，得到了電泳純且具有很高木聚糖酶活性的重組蛋白rXyn11C。
　　 rXyn11C專一地降解木聚糖底物，對山毛櫸木木聚糖表現(xiàn)出最高的酶活力。以山毛櫸木木聚糖為底物的Km值為4.030 mg/ml，Vmax值為0.533mmolmin-1mg-1;以樺木木聚糖為底物的Km值為

3、3.403 mg/ml，Vmax值為0.276mmolmin-1mg-1。rXyn11C的最適作用pH為7.0，在45℃反應(yīng)溫度下活性最高，在pH10.0 Tris-HCl緩沖液中孵育30min，殘留約50％活性，在45℃孵育30min殘留約40％活性，50℃處理30min，酶基本完全失活。在1mM的濃度下，Zn2+、Mn2+、Ag+、Fe2+、Fe3+、Cr3+、Co2+、pb2+、SDS對酶活有明顯的抑制作用;在10mM的濃度下，除

4、Li+、K+之外，大部分測定的金屬離子及化學(xué)試劑均能夠?qū)Xyn11C木聚糖酶活性產(chǎn)生不同程度的抑制，其中Cu2+、Fe3+、Hg2+離子能導(dǎo)致rXyn11C木聚糖酶活性的完全喪失;然而1mM和10mM的Tween20對酶活都具有明顯的促進(jìn)作用。薄層層析(TLC)發(fā)現(xiàn)，rXyn11C對山毛櫸木木聚糖的降解產(chǎn)物為多種低聚寡糖。rXyn11C僅能夠降解木四糖以上的寡糖，并產(chǎn)生高于底物聚合度的寡糖組分，同時顯示出降解活性和糖基轉(zhuǎn)移酶的合成活性

5、。木三糖能促進(jìn)rXyn11C對木四糖的糖基轉(zhuǎn)移作用，這種促進(jìn)作用隨著作用時間的延長越加明顯。
　　 簡單無機鹽濾紙培養(yǎng)基是纖維堆囊菌分離純化和培養(yǎng)保存的常規(guī)營養(yǎng)基質(zhì)。本文研究了S.cellulosum So0157-2在簡單無機鹽加濾紙（結(jié)晶纖維素）之外的其他糖類物質(zhì)作為唯一碳源進(jìn)行生長的能力。結(jié)果顯示出不同的利用能力，在以土豆淀粉、L-阿拉伯糖、糊精、葡萄糖、木聚糖等為唯一碳源時具有明顯的生長趨勢，而對木糖、羧甲基纖維素、殼聚

6、糖等糖類物質(zhì)的利用能力較弱。研究So0157-2以葡萄糖、木聚糖為唯一碳源的生長情況發(fā)現(xiàn)其在濃度為0.75％的CNST-G、CNST-X生長較好，在第1-2天達(dá)到最大生物量。
　　 細(xì)胞組分的空間分布可以通過細(xì)胞組分的分級分離并進(jìn)行檢測的方法進(jìn)行研究。本文選擇復(fù)雜培養(yǎng)基M26以及簡單培養(yǎng)基CNST-G和CNST-X培養(yǎng)So0157-2，收集濃縮培養(yǎng)液作為胞外游離組分，收集細(xì)胞并分離成膜組分和細(xì)胞內(nèi)可溶組分。對胞外游離組分、膜組分

7、和細(xì)胞內(nèi)可溶組分進(jìn)行酶活測定、酶譜分析和部分酶組分的western bolt檢測。結(jié)果顯示三種培養(yǎng)基來源的胞外游離組分、膜組分和細(xì)胞內(nèi)可溶組分均具有可檢測的木聚糖酶酶活和CMC酶活。膜組分的木聚糖酶活性占總木聚糖酶酶活的50％以上，可能在So0157-2利用木聚糖過程中起著重要作用。木聚糖酶酶譜分析發(fā)現(xiàn)胞外游離組分具有木聚糖酶活性，說明液體培養(yǎng)的So0157-2可能分泌木聚糖酶至細(xì)胞外，但M26，CNST-X培養(yǎng)的So0157-2胞外游

8、離組分的木聚糖水解條帶明顯多于CNST-G;三種培養(yǎng)基培養(yǎng)的So0157-2的細(xì)胞內(nèi)可溶組分的木聚糖酶酶譜都得到3條位置相同的水解條帶，可能是相同木聚糖酶的作用結(jié)果;CNST-X培養(yǎng)的So0157-2膜組分的酶譜最上面一條水解帶對應(yīng)的蛋白大小大于230kDa，與M26和CNST-G培養(yǎng)的So0157-2的膜組分酶譜不同。這些差異可能與培養(yǎng)基中淀粉、木聚糖和葡萄糖對木聚糖酶的表達(dá)的誘導(dǎo)和阻遏作用有關(guān)。以CMC為底物的酶譜分析發(fā)現(xiàn)各個組分都

9、能形成多條水解條帶，對應(yīng)著多種CMC酶，其蛋白大小主要分布在25kDa-100 kDa之間，不同培養(yǎng)基培養(yǎng)的So0157-2的組分的CMC酶酶譜有多處不同，表現(xiàn)在CMC酶的種類及相對含量上。利用抗-rXyn11A多克隆抗體進(jìn)行的Western Blot在各組分中都雜交出多條條帶。在Xyn11A的理論分子量的位置，3種細(xì)胞內(nèi)可溶組分及CNST-G的胞外游離組分中有兩條雜交條帶。
　　 細(xì)胞組分的細(xì)胞空間分布還可以采用細(xì)胞原位定位的

10、方法。本文選取CNST-F平板培養(yǎng)的So0157-2細(xì)胞，用25％蔗糖質(zhì)壁分離處理后，包埋、固定后制備了超薄切片。利用抗-rXyn11A多克隆抗體，通過免疫膠體金標(biāo)記、透射電鏡檢測研究Xyn11A的細(xì)胞定位情況，建立了在纖維堆囊菌中進(jìn)行蛋白細(xì)胞原位定位的操作體系。透射電鏡結(jié)果顯示，陰性對照E.coli BL21(DE3)-pET-22b細(xì)胞及細(xì)胞外面均勻分布少量非特異性結(jié)合金顆粒;陽性對照E.coli BL21(DE3)-pET-22b