草酸青霉菌P8（Penicillium oxalicum）的GFP和潮霉素抗性基因標(biāo)記及其作物根際定殖的研究.pdf

1、草酸青霉菌P8(Penicilliumoxalicum)由中國(guó)農(nóng)科院土肥所菌種保藏中心范丙全從土壤中分離獲得。在溫室盆栽條件下施用P8能有效溶解土壤中難溶磷，對(duì)花生、油菜、玉米等作物都產(chǎn)生明顯的促生作用。本試驗(yàn)用GFP(GreenFluorescentProten)和潮霉素抗性的雙標(biāo)記載體標(biāo)記溶磷菌株草酸青霉菌P8，篩選穩(wěn)定、高效表達(dá)GFP并對(duì)潮霉素產(chǎn)生抗性的雙標(biāo)記轉(zhuǎn)化菌株，應(yīng)用激光共聚焦顯微鏡原位觀察研究其在作物根際的空間分布、繁殖和

2、存活能力。主要研究?jī)?nèi)容如下： (一)應(yīng)用基因重組技術(shù)，利用真核表達(dá)載體pNOM102作為重組質(zhì)粒的骨架載體，將潮霉素抗性和加強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)融合基因裝在強(qiáng)基因表達(dá)信號(hào)GPD(3-磷酸甘油醛脫氫酶)啟動(dòng)子和TtrpC中止子表達(dá)框之間，構(gòu)建了用于標(biāo)記草酸青霉菌(Penicilliumoxalicum)P8絲狀真菌表達(dá)載體pHYGEGFP。 (二)對(duì)草酸青霉菌P8的原生質(zhì)體形成和再生條件進(jìn)行研究。從制備P8孢子懸液

3、開始，對(duì)菌齡、破壁酶系統(tǒng)、滲透壓穩(wěn)定劑種類及濃度、酶解時(shí)間和溫度、再生培養(yǎng)基等影響原生質(zhì)體形成和再生的主要因素進(jìn)行了研究，總結(jié)出一套高效制備草酸青霉菌原生質(zhì)體的方法，得出青霉菌P8菌株原生質(zhì)體形成的最適宜條件是：菌齡18h，25mg/mL的蝸牛酶和纖維素酶混合酶體系，pH為6.0的0.6mol/LNaCl的滲透壓穩(wěn)定劑，酶解2.5～3h，原生質(zhì)體產(chǎn)量可以達(dá)到106～107cfu/mL；用平板稀釋法以0.6mol/LNaCl、0.8％瓊脂

4、的CM培養(yǎng)基培養(yǎng)原生質(zhì)體上，再生率最高達(dá)60％以上。 (三)質(zhì)粒DNApHYGEGFP經(jīng)PEG介導(dǎo)轉(zhuǎn)化青霉菌P8原生質(zhì)體，篩選出高效、穩(wěn)定表達(dá)潮霉素B抗性和綠色熒光蛋白基因的5株青霉菌轉(zhuǎn)化菌株；轉(zhuǎn)化菌株與野生型菌株P(guān)8的形態(tài)學(xué)特征和生理學(xué)特征經(jīng)微生物學(xué)方法分析沒有明顯差異。青霉菌P8導(dǎo)入外源基因后并不影響其高效溶磷能力。繼代轉(zhuǎn)接和Southern雜交分析表明，外源DNA非特異整合到真菌的基因組DNA上，隨宿主菌的轉(zhuǎn)代而穩(wěn)定遺傳。

5、 (四)利用激光共聚焦掃描顯微鏡可觀察到土壤中P8-b的綠色菌絲和分生孢子。用激光共聚焦顯微鏡原位觀察青霉菌P8-b在玉米根際的定殖狀況，表明P8-b可在玉米生長(zhǎng)繁殖并穩(wěn)定定殖于玉米的根際；青霉菌P8-b在營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)豐富的種子胚乳表面及根表上部根段定殖較好。 (五)溫室條件下研究了不同栽培條件對(duì)青霉菌P8-b定殖的影響。青霉菌P8-b在玉米、大豆、棉花、小麥、花生不同類型作物根際都能生存定殖。根際定殖數(shù)量最高達(dá)105～10