大黃酸-羥基紅花黃色素A藥單用及合用對慢性腎病的藥效學及藥動學研究.pdf

1、在中醫(yī)藥理論中，中醫(yī)學家認為慢性腎臟疾?。–hronic Kidney Disease,CKD）的基本病機特點是“本虛標實，虛實夾雜”，本虛以肺、脾、腎等臟虛損為主，尤其強調(diào)腎臟的虛損。標實有風、寒、濕、熱、血瘀等，尤以血瘀與濕熱為多，其中血瘀證貫穿CKD發(fā)生和發(fā)展的始終。
　　因此，傳統(tǒng)中醫(yī)藥在CKD的治療中始終堅持以活血化瘀治療為主，以神農(nóng)嘗百草的方式經(jīng)過千年的優(yōu)化組方，形成了數(shù)百種今天臨床廣泛使用治療CKD有效的中藥方劑。以

2、活血化瘀藥物紅花與大黃為主組成的方劑和中成藥就有數(shù)百種（如：腎康注射液、尿毒清顆粒、糖腎II號膠囊、腎衰寧膠囊等），僅“腎康注射液”年銷售額已達10億，這些藥物在臨床治療CKD療效確切，應(yīng)用廣泛，并且大黃中的有效成分大黃酸（Rhein）近來已獲批作為治療糖尿病腎病的中藥一類新藥即將進入I/II期臨床試驗，這使得我們有理由確信大黃在中藥配伍治療DN中發(fā)揮著關(guān)鍵且不可替代的作用，但大黃-紅花活血抗炎、抗氧化應(yīng)激和抗凋亡損傷的聯(lián)合保護作用機制

3、不明。
　　前期，我們在國科金（No.81173514;No.81470174）中，用首創(chuàng)的“藥效差示血清色譜法”研究發(fā)現(xiàn)，大黃酸（Rhein）及羥基紅花黃色素A(HSYA)是紅花和大黃的主要有效成分，HSYA具有改變血液流變學、抗氧化、清除自由基及抗細胞凋亡率的作用；Rhein具有抑制脂質(zhì)過氧化物、清除自由基及抗纖維化的的能力。但是，大黃酸和HSYA單體單用及合用分別在CKD的確切作用及機制尚不清楚。本課題擬在藥動學及藥效學兩方

4、面揭示Rhein–HSYA配伍的內(nèi)在相互作用機制，為今后含有Rhein–HSYA的方劑和中成藥研究提供創(chuàng)新性思路。
　　目的：
　　第一部分：大黃酸（Rhein，RH）和羥基紅花黃色素A（Hydroxy saffloweryellow A, HSYA）單用及合用改善SD大鼠單側(cè)輸尿管結(jié)扎（unilateral ureteral obstruction，UUO）梗阻模型的藥效學實驗
　　建立SD大鼠UUO梗阻模型，通過檢

5、測抗炎、抗氧化、抗凋亡相關(guān)指標，明確RH和HSYA單用及合用治療慢性腎病的作用及其機制。
　　第二部分：闡明RH和HSYA聯(lián)用在藥動學上相互作用規(guī)律的實驗
　　運用LC/MS/MS技術(shù)，建立體內(nèi)同時測定RH和HSYA濃度的方法，比較大黃、紅花單用及合用后RH和HSYA在大鼠體內(nèi)的吸收、分布、消除等參數(shù)的變化情況，從藥動學角度闡明兩藥合用后的協(xié)同作用機理。
　　方法：
　　第一部分：藥效學實驗
　　1.分組、

6、給藥和樣本采集：通過SD大鼠單側(cè)輸尿管結(jié)扎建立慢性腎臟疾?。–KD, Chronic kidney disease）模型，模擬臨床的CKD。將30只SD大鼠隨機分為對照假手術(shù)（sham）組、模型(model)組、RH（rhein）治療組（100mg/kg/d）、HSYA治療組（50mg/kg/d）及RH（100mg/kg/d）+HSYA（50mg/kg/d）治療組，每組6只。SD大鼠UUO手術(shù)后連續(xù)給藥兩周，每天一次。兩周后處死大鼠，采

7、集腎組織和血樣，檢測血生化指標肌酐（Cr）和尿素氮（BUN）水平，HE染色觀察腎組織病理學的變化，進行藥效評價。
　　2.抗炎作用：ELISA法分別檢測血清中白介素--1β（Interleukin-1β, IL-1β）、白介素-6（Interleukin-6, IL-6）、腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)、單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1, Monocyte chemotactic p

8、rotein-1)的炎性因子含量，Westrn blot法檢測炎癥通路相關(guān)蛋白NF-kB、IkBα的表達，評價藥效物質(zhì)的抗炎作用。
　　3.抗氧化作用：試劑盒檢測腎組織丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量、超氧化物岐化酶(superoxide dismutase, SOD)及谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px, glutathione peroxidase)活性變化。
　　4.抗凋亡作用：TUNEL染色法檢測

9、腎組織細胞凋亡情況，Western Blot法檢測凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax及caspase-3的表達，并進一步檢測了P38MAPK激酶蛋白表達，評價藥效物質(zhì)的抗氧化、抗凋亡作用。
　　第二部分：藥動學實驗
　　取正常SD大鼠18只，體重(250±20g)，適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后，禁食12h，自由飲水，隨機分為3組，分別以13.5g·kg-1(0.5％CMC-Na混懸)灌胃量給予大鼠大黃(rhubarb)、紅花(safflow

10、er)及大黃+紅花（rhubarb+safflower，1:1）在給藥前5min和給藥后2 min,8 min,15 min,30min,45min,1 h,2 h,4 h,6 h,8 h后，進行眼底靜脈叢取血(400μL)，肝素鈉抗凝，4000r·min-14℃離心l0min，精密量取上清血漿置另一EP管中，-80℃冰箱保存待測。血樣經(jīng)過前處理后，采用液質(zhì)聯(lián)用(LC/MS/MS)儀同時測定血漿中RH與HSYA的濃度。測定結(jié)果用Phoe

11、nix Win-Nonlin5.0.1軟件進行分析，以擬合度和AIC值作為判斷標準，并且選擇適當?shù)姆渴夷Ｐ?，計算其藥動學參數(shù)。
　　結(jié)果：
　　第一部分：藥效學實驗
　　1. RH、HSYA單用及兩藥聯(lián)用治療組與模型組相比，均可顯著降低大鼠血清中肌酐（Scr）（P<0.05）、尿素氮（BUN）(P<0.05)含量，且聯(lián)用效果優(yōu)于單用組；HE染色顯示模型組大鼠腎小球結(jié)構(gòu)不完整，大量炎性細胞浸潤，治療組大鼠腎組織病理改變得

12、到明顯改善，且聯(lián)用效果優(yōu)于單用組。
　　2.抗炎作用：在UUO大鼠體內(nèi)，RH和HSYA單用及聯(lián)用組與模型組相比，均能顯著抑制炎癥反應(yīng)，降低IL-1β、IL-6、TNF-α、MCP-1因子含量（P<0.05），其機制為抑制NF-kB通路相關(guān)蛋白的表達，且兩藥聯(lián)用的抗炎作用優(yōu)于單味藥。
　　3.抗氧化作用：在UUO大鼠體內(nèi)，RH和HSYA單用及聯(lián)用組與模型組相比，均能顯著抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)，降低腎組織中MDA含量，升高SOD、GS

13、H活性（P<0.05），且兩藥聯(lián)用的抗氧化作用優(yōu)于單味藥。
　　4.抗凋亡作用：在UUO大鼠體內(nèi)，RH和HSYA單用及聯(lián)用組與模型組相比，均可降低TUNEL陽性染色率，抑制腎組織細胞凋亡，其機制為降低損傷的組織中Bax、Cleaved caspase-3蛋白表達，上調(diào)Bcl-2蛋白表達，且兩藥合用的抗凋亡作用優(yōu)于單味藥。進一步研究發(fā)現(xiàn)兩藥合用還能抑制磷酸化的P38蛋白表達，證實了P38級聯(lián)激酶在UUO模型中被激活，且參與了下游炎癥

14、、氧化應(yīng)激和凋亡反應(yīng)。
　　第二部分：藥動學實驗
　　在電噴霧離子源ESI(-)離子化條件下，采用多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式分別檢測RH(m/z283.8→239.7)、HSYA(m/z611.4→492.0)及內(nèi)標布洛芬(m/z205.6→161.6）。RH在100.0-5800 ng/mL范圍內(nèi)(R2=0.9977)、HSYA在35.0-3500 ng/mL范圍內(nèi)(R2=0.9986)呈良好線性關(guān)系?？诜o藥后RH及HSY

15、A在大鼠體內(nèi)符合二室開放模型，兩者合用給藥后單用和合用給藥后，紅花中HSYA動學參數(shù)具有明顯統(tǒng)計學差異。HSYA AUC0–∞值（3087.26±933.73）（P<0.01）及Cmax值(1894.39±942.20)(P<0.05)均顯著高于單藥組中HSYA AUC0–∞(1694.73±753.28)及Cmax值(301.09±135.73)；而HSYA t1/2z值(3.94±0.68)及MRT0–t值(0.58±0.30)低于

16、單藥組中HSYA t1/2z值(5.08±2.54)及MRT0–t值(0.71±0.19)；相應(yīng)的，RH AUC0–∞值(7167.861±3108.36)Cmax值(3250.12±1416.18)高于單藥組中RH AUC0–∞值（7121.855±4241.50）（P>0.05）及Cmax值(2732.97±1905.99)（P>0.05）。
　　結(jié)論：
　　第一部分：藥效學實驗
　　1.大黃酸和羥基紅花黃色素A聯(lián)

17、用比單用具有明確的改善腎組織損傷的作用。
　　2.大黃酸和羥基紅花黃色素A聯(lián)用比單用發(fā)揮更好的抑制炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激和細胞凋亡的作用。
　　3.大黃酸和羥基紅花黃色素A聯(lián)用通過阻止P38MAPK和NF-kB信號通路保護UUO損傷的腎組織。
　　第一部分：藥效學實驗
　　1.本文首次建立了同時測定體內(nèi)大黃酸和羥基紅花黃色素A的方法，通過藥動學實驗分析大黃、紅花單用及合用后體內(nèi)大黃酸和HSYA藥動學變化，結(jié)果表明，兩