兩個(gè)腎性尿崩癥家系A(chǔ)VPR2基因突變的研究.pdf

1、目的：近年來國(guó)外學(xué)者對(duì)X．連鎖隱性遺傳腎性尿崩癥的分子病因作了大量的研究，他們利用分子生物學(xué)技術(shù)已在不同的家系發(fā)現(xiàn)了180余種不同的基因突變。國(guó)內(nèi)學(xué)者雖然也報(bào)道了若干腎性尿崩癥家系，但對(duì)該病致病基因方面的研究進(jìn)行得很少。我們對(duì)于臨床發(fā)現(xiàn)的兩個(gè)先天性腎性尿崩癥家系利用多聚酶鏈反應(yīng)(polymerasechainreaction，PCR)直接測(cè)序的方法，進(jìn)行精氨基酸加壓素2型受體(argininevasopressinreceptor2，A

2、VPR2)基因的突變檢測(cè)。 方法：經(jīng)過臨床詢問病史，血、尿生化檢驗(yàn)以及禁水-加壓素試驗(yàn)診斷兩例“腎性尿崩癥”，并且通過家系調(diào)查確診兩個(gè)X．連鎖隱性遺傳的腎性尿崩癥家系。采集臨床診斷為先天性腎性尿崩癥的這兩個(gè)家系成員(包括5例患者及其20名親屬)的外周血，按酚．氯仿法提取基因組DNA；在GenBank數(shù)據(jù)庫中查找到AVPR2基因的DNA序列，應(yīng)用Primer3軟件對(duì)其全部編碼區(qū)及其鄰近內(nèi)含子設(shè)計(jì)5對(duì)引物；通過PCR的方法擴(kuò)增這5個(gè)

3、片段；并對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行DNA直接測(cè)序，最后用DNAStar軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析，尋找基因突變位點(diǎn)。 結(jié)果：應(yīng)用這兩個(gè)家系成員的DNA樣本對(duì)上述5個(gè)片段分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度分別為：422bp、480bp、450bp、476bp以及470bp，家系1的所有成員均獲得相應(yīng)的目的片段，進(jìn)一步做DNA測(cè)序分析顯示，在這3個(gè)患者中發(fā)現(xiàn)AVPR2基因的一個(gè)突變位點(diǎn)：g．1236T>C，突變位于AVPR2基因的第2個(gè)外顯子，即

4、AVPR2基因第1236位點(diǎn)的堿基T被C替換，致使受體蛋白第292位的亮氨酸(CTG)被脯氨酸(CCG)所替代(L292P)。3位患者的母親雖然在臨床上沒有腎性尿崩癥的表型，但是她們的基因測(cè)序結(jié)果顯示，在其AVPR2g．1236位點(diǎn)的等位基因上同時(shí)存在堿基T和C，提示她們?yōu)锳VPR2g．1236T>C的雜合突變。在家系2中，8個(gè)正常人均擴(kuò)增出這5個(gè)PCR片斷，測(cè)序結(jié)果與GenBank中序列相同，但在2個(gè)患者中未能擴(kuò)增出相應(yīng)的片斷，推測(cè)在

5、這一家系中可能存在該基因部分或全部的缺失。重新設(shè)計(jì)引物，并應(yīng)用步移法逐段行PCR，最后通過引物對(duì)7F／9R擴(kuò)增出包含缺失范圍在內(nèi)的一段1160bp的產(chǎn)物，進(jìn)～步測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)：這一家系的2個(gè)患者中存在包含整個(gè)AVPR-2基因和鄰近的C1基因的最后一個(gè)外顯子及部分的內(nèi)含子在內(nèi)的一個(gè)5995bp片斷的缺失以及GAG三個(gè)堿基的插入。將缺失片段與GenBank序列作比對(duì)，顯示缺失的核苷酸序列的5’端位于L1CAM和AVPR2基因的間區(qū)，3’端位于

6、C1基因的內(nèi)含子-2l中。意即這一5995bp的缺失片段包含了整個(gè)AVPR2基因、C1基因的最后一個(gè)外顯子(外顯子-22)及最后一個(gè)內(nèi)含子(內(nèi)含子-21)的部分。兩位患者的母親及其外祖母也擴(kuò)增出1160bp的異常PCR產(chǎn)物，提示：她們?yōu)樵撏蛔兊碾s合子。 結(jié)論：本研究發(fā)現(xiàn)了中國(guó)人X．連鎖隱性遺傳的腎性尿崩癥的兩個(gè)新的AVPR2基因突變類型：1．g．1236T>C；2．一個(gè)包含整個(gè)AVPR2基因和鄰近的C1基因的最后一個(gè)外顯子及部分

7、內(nèi)含子在內(nèi)的一個(gè)5995bp片斷的缺失以及GAG三個(gè)堿基的插入。前者導(dǎo)致AVPR2受體蛋白在292位點(diǎn)上氨基酸的改變(L292P)，使受體第6個(gè)跨膜域的亮氨酸被脯氨酸所取代，從而裂解了Q．螺旋結(jié)構(gòu)，由此干擾了AVPR2的正常折疊和轉(zhuǎn)運(yùn)，致使其在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留，而在細(xì)胞膜表面的表達(dá)水平極低，且不能與AVP結(jié)合，從而使腺苷環(huán)化酶活性下降，細(xì)胞對(duì)水的通透性下降，引起尿崩癥。后者則是由于整個(gè)AVPR2基因的缺失使該受體蛋白缺失、沒有表達(dá)，由此出現(xiàn)尿