脂質(zhì)運(yùn)載蛋白-2對(duì)人類卵巢癌細(xì)胞增殖能力的影響以及相關(guān)分子機(jī)制的研究.pdf

1、目的：卵巢癌患者早期癥狀隱匿，確診時(shí)已處于晚期，導(dǎo)致卵巢癌患者的死亡率居?jì)D科腫瘤之首，對(duì)婦女生命造成嚴(yán)重威脅。脂質(zhì)運(yùn)載蛋白-2（LCN2）是一種25kDa的外分泌型糖蛋白，有研究表明LCN2的表達(dá)量與卵巢癌的惡性程度密切相關(guān)。然而，有關(guān)LCN2在卵巢癌細(xì)胞中的作用及機(jī)制還不明確。本研究將檢測(cè)LCN2的表達(dá)與卵巢癌臨床病理特征的相關(guān)性，以及LCN2對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖活力的影響，并初步探討相關(guān)信號(hào)通路的分子機(jī)制。
　　方法：通過(guò)免疫組化

2、方法檢測(cè)LCN2在正常卵巢組織與卵巢腫瘤組織中的表達(dá)程度，統(tǒng)計(jì)評(píng)估LCN2與卵巢癌臨床病理特征的相關(guān)性；應(yīng)用MTT細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)和平板細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)過(guò)表達(dá)LCN2對(duì)卵巢癌細(xì)胞系（ES2和SKOV3）增殖活力的影響；通過(guò)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染LCN2質(zhì)粒DNA加藥物篩選的方法構(gòu)建穩(wěn)定過(guò)表達(dá)LCN2的卵巢癌細(xì)胞系；通過(guò)磷酸蛋白芯片篩選過(guò)表達(dá)LCN2后產(chǎn)生的相關(guān)差異表達(dá)的蛋白；應(yīng)用Western Blot和細(xì)胞免疫熒光法驗(yàn)證部分差異蛋白的亞細(xì)胞定位及表

3、達(dá)強(qiáng)度的變化。
　　結(jié)果：
　　1.免疫組織化學(xué)結(jié)果：LCN2在正常卵巢組織中呈陰性表達(dá)，在卵巢癌組織中有不同程度的陽(yáng)性表達(dá)。表達(dá)程度量化評(píng)分后，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，LCN2在卵巢癌組織中表達(dá)量高于正常卵巢組織并與卵巢癌組織分化程度具有顯著性差異（P<0.0001）。
　　2.MTT細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果：選擇相對(duì)低表達(dá)LCN2的兩個(gè)卵巢癌細(xì)胞系（ES2和SKOV3），瞬時(shí)轉(zhuǎn)染LCN2質(zhì)粒和空白對(duì)照質(zhì)粒48h之后，過(guò)表達(dá)LCN

4、2組的細(xì)胞增殖活力高于對(duì)照組。
　　3.平板細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果：分別在ES2和SKOV3細(xì)胞中，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染等量的LCN2質(zhì)粒和空白對(duì)照質(zhì)粒，經(jīng)G418篩選至克隆形成，結(jié)果顯示過(guò)表達(dá)LCN2組克隆形成率明顯多于對(duì)照組。
　　4.磷酸蛋白芯片實(shí)驗(yàn)結(jié)果：在卵巢癌細(xì)胞系中，利用已經(jīng)成功構(gòu)建的穩(wěn)定高表達(dá)LCN2細(xì)胞系，磷酸蛋白芯片篩選結(jié)果顯示過(guò)表達(dá)LCN2組相對(duì)于對(duì)照組，ERK和GSK3β的磷酸化水平均明顯上調(diào)。
　　5.Wes

5、tern Blot檢測(cè)結(jié)果：首先在四種卵巢癌細(xì)胞系（ES2、SKOV3、CAOV3、OVCAR3）中分別檢測(cè)了LCN2、磷酸化ERK（p-ERK）、ERK、磷酸化GSK3β（p-GSK3β）和GSK3β及β-catenin的蛋白表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)LCN2高表達(dá)的細(xì)胞系（CAOV3和OVCAR3）對(duì)比LCN2低表達(dá)的細(xì)胞系（ES2和SKOV3），磷酸化ERK和磷酸化GSK3β的表達(dá)水平上調(diào)。隨后，在穩(wěn)定過(guò)表達(dá)LCN2的ES2和SKOV3細(xì)胞系

6、中再次驗(yàn)證LCN2、磷酸化ERK、ERK、磷酸化GSK3β和GSK3β的蛋白表達(dá)水平，結(jié)果顯示過(guò)表達(dá)LCN2上調(diào)了磷酸化ERK、磷酸化GSK3β和β-catenin的表達(dá)。
　　6.細(xì)胞免疫熒光結(jié)果：在SKOV3細(xì)胞系中瞬時(shí)轉(zhuǎn)染pEGFPN3和pEGFPN3-LCN2質(zhì)粒DNA，發(fā)現(xiàn)成功轉(zhuǎn)染LCN2組中，LCN2、磷酸化ERK、磷酸化GSK3β及β-catenin的表達(dá)強(qiáng)度相對(duì)于對(duì)照組有明顯增加。
　　結(jié)論：
　　1.