雄激素、雌激素與IL-6和IL-8促卵巢癌細胞增殖分子機制的研究以及Raf激酶抑制蛋白與卵巢癌轉(zhuǎn)移關(guān)系的初步探討.pdf

1、目的：卵巢癌(OvarianCancer，OVCA)中90％以上起源于卵巢表面上皮，流行病學調(diào)查、實驗研究及臨床資料分析表明OVCA的發(fā)生、發(fā)展與雌激素和雄激素關(guān)系密切。近年來研究表明，白細胞介素-6(Interleukine-6，IL-6)和白細胞介素-8(Interleukine-8，IL-8)在OVCA中高表達，提示這兩種細胞因子可能在OVCA的發(fā)生、發(fā)展中起著十分重要的作用。目前關(guān)于雄激素、雌激素及IL-6、IL-8兩種細胞因子

2、在OVCA中作用的機制尚不十分清楚。本課題探討了這兩種性激素與這兩種細胞因子對上皮性O(shè)VCA細胞增殖作用的影響，并對雄激素、雌激素與IL-6、IL-8兩種細胞因子間可能存在的相互調(diào)節(jié)作用及相關(guān)分子機制進行了研究。 另外，OVCA轉(zhuǎn)移是影響其預后的主要原因，但有關(guān)其侵襲和轉(zhuǎn)移的分子機制尚不明確。近期研究發(fā)現(xiàn)Raf激酶抑制蛋白(Rafkinaseinhibitorprotein，RKIP)在前列腺癌、乳腺癌、黑色素細胞瘤、胰島細胞瘤

3、等惡性腫瘤中表達減弱或丟失，RKIP基因很可能是前列腺癌、黑色素細胞瘤及乳腺癌的一種轉(zhuǎn)移抑制基因。然而，RKIP在OVCA中的表達及作用尚未見報道，為了研究RKIP與OVCA轉(zhuǎn)移的相關(guān)性，本課題初步探討了RKIP在OVCA組織及五種OVCA細胞系中表達的情況，在此基礎(chǔ)上進一步探討了RKIP在OVCA轉(zhuǎn)移和發(fā)展中的可能作用機制。 方法：本課題分兩部分進行研究，第一部分雄激素、雌激素與IL-6和IL-8促OVCA細胞增殖分子機制的研

4、究。應用免疫印跡(WesternBlot)和逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(reversetranscriptionpolymerasechainreaction，RT-PCR)技術(shù)對五種常見的人上皮性O(shè)VCA細胞系雄激素受體(androgenreceptor，AR)、雌激素受體(estrogenreceptor，ER)α、ERβ、IL-6受體(IL-6Rα、gp130)及IL-8受體(IL-8RA、IL-8RB)的表達進行研究，選擇兼有AR和/

5、或ER、IL-6R及IL-8R的OVCA細胞系作為研究模型，應用MTT法觀察5α-二氫睪酮(5α-dihydrotestosterone，DHT)、17β-雌二醇(17β-estradiol，E2)及IL-6、IL-8兩種細胞因子對OVCA細胞體外增殖作用的影響；應用酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme-1inkedimmnosorbentassay，ELISA)、RT-PCR、WesternBlot及熒光素酶報告基因檢測技術(shù)觀察DHT、E2

6、對OVCA細胞IL-6、IL-8及其受體表達的調(diào)節(jié)作用以及IL-6、IL-8對OVCA細胞AR、ERα、ERβ表達的調(diào)節(jié)作用。第二部分RKIP與OVCA轉(zhuǎn)移關(guān)系的研究。首先應用免疫組化技術(shù)對人卵巢上皮性腫瘤組織(10例卵巢良性上皮性腫瘤、8例交界性O(shè)VCA及22例上皮性O(shè)VCA)和OVCA細胞系高轉(zhuǎn)移性HO-8910PM細胞及其母系細胞低轉(zhuǎn)移性HO-8910細胞中RKIP的表達和分布情況進行檢測，同時應用RT-PCR、WesternBl

7、ot及Transwell小室體外侵襲實驗對五種人上皮性O(shè)VCA細胞系的RKIP表達水平與其體外侵襲能力的相關(guān)性進行分析。在此基礎(chǔ)上應用脂質(zhì)體法將含正義(sense，ss)或反義(antisense，as)RKIPcDNA的表達載體導入人OVCA細胞系SKOV-3，G418篩選陽性克隆后，WesternBlot檢測轉(zhuǎn)染前后細胞中RKIP蛋白的表達水平及RKIP表達對OVCA細胞MAP激酶活性的作用。分別應用MTT法、流式細胞儀、雙層軟瓊脂

8、集落形成實驗、體外細胞粘附實驗、Transwell小室體外侵襲實驗、ELISA及RT-PCR技術(shù)，比較轉(zhuǎn)染前后細胞體外增殖能力、細胞周期分布和凋亡、錨定非依賴性生長能力、粘附和侵襲能力及IL-6和IL-8表達能力的變化。 結(jié)果：第一部分雄激素、雌激素與IL-6和IL-8促OVCA細胞增殖分子機制的研究結(jié)果顯示：(1)DHT和E2除促進OVCA細胞增殖外還明顯提高其IL-6、IL-8的分泌，并對二者膜受體的表達有一定的調(diào)節(jié)作用。I

9、L-6和IL-8也可促進OVCA細胞增殖。AR阻斷劑氟他胺(flutamide，F(xiàn)lu)和ER阻斷劑他莫昔芬(tamoxifen，Txf)可分別完全阻斷DHT和E2誘導的促增殖及IL-6和IL-8表達的作用，而抗IL-6/IL-8中和抗體則可部分阻斷二者的促增殖作用。IL-6和IL-8誘導的促增殖作用可被其相應的中和抗體完全阻斷，也可被ER阻斷劑Txf部分阻斷，AR阻斷劑Flu非但不能阻斷IL-6和IL-8的促增殖作用，反而增強二者的促

10、增殖效應。(2)在無雄激素的條件下，IL-6和IL-8除能增加AR表達外還能活化AR基因啟動子；同樣，在無雌激素的條件下，IL-6和IL-8除能活化雌激素敏感基因啟動子外還能上調(diào)功能性ERα的表達和下調(diào)ERβ蛋白的表達；二者活化AR基因啟動子及雌激素敏感基因啟動子的作用可被AR阻斷劑Flu和ER阻斷劑Txf完全阻斷。(3)除wortmannin(PI-3K抑制劑)外，SB202190(p38MAPK抑制劑)、PD98059(MEK1/2

11、抑制劑)及tyrphostinAG879(ErbB2MAPK抑制劑)均可明顯阻斷IL-6誘導的ARmRNA增加及雌激素敏感基因啟動子的活化；而PP2(Src抑制劑)則可明顯阻斷IL-8誘導的ARmRNA增加及雌激素敏感基因啟動子的活化。 第二部分RKIP與OVCA轉(zhuǎn)移關(guān)系的研究結(jié)果顯示：(1)上皮性O(shè)VCA患者組織中的RKIP表達水平明顯低于良性上皮性腫瘤和交界性O(shè)VCA患者的水平，其中低分化者顯著低于中分化和高分化者；(2)五

12、種上皮性O(shè)VCA細胞中RKIP的表達水平與其體外侵襲能力基本呈負相關(guān)；(3)篩選出穩(wěn)定表達重組pcDNA3.1(+)-ssRKIP和pcDNA3.1(-)-asRKIP的SKOV-3細胞。RKIP表達水平對OVCA細胞中Raf-1介導的MEK和ERK基礎(chǔ)活化水平有抑制作用；(4)ssRKIP轉(zhuǎn)染組細胞的增殖能力、錨定非依賴性生長能力、粘附能力、侵襲能力及IL-8表達能力均明顯低于空載體pcDNA3.1(+)轉(zhuǎn)染組細胞和/或未轉(zhuǎn)染的對照組

13、細胞；asRKIP轉(zhuǎn)染組細胞的增殖能力、錨定非依賴性生長能力、粘附能力、侵襲能力及IL-8表達能力則明顯高于空載體pcDNA3.1(-)轉(zhuǎn)染組細胞和/或未轉(zhuǎn)染的對照組細胞；(5)與未轉(zhuǎn)染細胞和轉(zhuǎn)染空載體細胞相比，轉(zhuǎn)染ssRKIP細胞呈現(xiàn)G1期細胞阻滯和G2+S期細胞比例下降，而轉(zhuǎn)染asRKIP細胞則呈G1期細胞比例減少和G2+S期細胞比例增加，提示RKIP通過改變細胞周期分布，而不是通過誘導凋亡(各組細胞均未見明顯的凋亡峰)抑制OVCA

14、細胞的生長。 結(jié)論：本課題初步闡明了雄激素、雌激素與細胞因子IL-6和IL-8共同促進OVCA生長和發(fā)展的一個嶄新機制，即兩種性激素與IL-6和IL-8兩種細胞因子可能在OVCA進展中交互調(diào)節(jié)形成級聯(lián)放大效應。 RKIP基因不僅對OVCA細胞的侵襲轉(zhuǎn)移有抑制作用，且對其生長也有抑制作用。鑒于轉(zhuǎn)移抑制基因定義為該基因編碼的蛋白只抑制轉(zhuǎn)移癌生長，而不影響原發(fā)腫瘤的生長，故我們認為RKIP似乎并不是上皮性O(shè)VCA的轉(zhuǎn)移抑制基因