IL-8對不同轉移潛能肝癌細胞增殖和侵襲的影響以及肝癌和乳腺癌中IL-8與EGFR信號通路的關系.pdf

1、一、研究背景及目的: IL-8屬于趨化因子超家族中的一個成員，是～種內源性和多源性細胞因子，因其能激活和趨化中性粒細胞而被發(fā)現(xiàn)，在炎癥反應中起重要作用。1 990年Modi用原位雜交將IL-8基因定位于人染色體4q12-21，全長5191 bp，由4個外顯子和3個內含子組成。根據氨基酸序列分析，IL-8分子量(SDS．PAGE)為8Kda，其成熟形式有5種，分別由79個、77個、72個、70個和69個氨基酸殘基組成。應用重組技術

2、，在大腸桿菌內表達IL-8基因而得到的主要形式的IL-8是由72個氨基酸殘基組成。關于IL-8基因表達的調節(jié)，目前的文獻主要集中于其在轉錄水平的調控。在IL-8啟動子上有多個位點可結合幾種不同的轉錄因子，其中有兩個區(qū)域對IL-8的轉錄調節(jié)非常重要，它們分別是遠端結合AP．1的位點和近端結合NF-K B及NF-IL-6的位點。這些結合轉錄因子的位點在結構上緊密相關，功能上相互作用，是調節(jié)IL-8啟動子功能的主要順式作用元件。在許多類型細胞

3、中都已證實IL-8基因的表達需要這些元件之間高度的協(xié)同以達到有效的轉錄。 IL-8是一種糖蛋白，與受體結合后發(fā)生作用。IL-8受體(IL-8receptor，IL-8R)是一個由59 Kda和67 Kda亞單位組成的二聚體糖蛋白，屬于7跨膜區(qū)G蛋白耦聯(lián)受體(GPCR)家族，CD編號為CDw128，存在于多種類型的細胞膜上，甚至包括一些不表達IL-8的細胞。IL-8與受體結合引起的反應主要是通過細胞膜上G蛋白耦聯(lián)的磷脂酰肌醇途徑產

4、生的。IL-8受體與百日咳毒素(PTX)敏感的GTP結合蛋白耦合，激活磷脂酶Cβ(PLC<,β>)，將磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸(PIP<,2>)分解為三磷酸肌醇(IP<,3>)和二酰甘油(DG)，同時產生兩個胞內第二信使，分別激動兩個信號傳遞途徑即IP<,3>/Ca<'2+>和DG/PKC通路：IP<,3>通過作用于內質網膜上特異的受體使其內部Ca<'2+>釋放，引起胞內Ca<'2+>水平的增加，從而啟動胞內Ca<'2+>信號系統(tǒng)，即

5、通過依賴Ca<'2+>、鈣結合蛋白的酶類活性變化來調節(jié)生理過程；DG則通過激活PKC，以磷酸化的形式對許多蛋白質和酶類進行修飾，從而調節(jié)和控制另外一系列的生理過程。在這兩個信號傳遞途徑中，參與細胞的DNA和蛋白質合成、細胞的生長分化以及轉錄調節(jié)的主要是DG/PKC通路。目前已知至少有兩種不同類型的IL-8R，Ⅰ型受體(CXCRl)特異性地與IL-8結合，Ⅱ型受體(CXCR2)除了與IL-8結合外，還可以和生長相關癌基因(GR0)、單核細

6、胞炎性蛋白-2(MIP-2)和中性粒細胞活化肽-2(NAP-2)等結合。編碼兩種類型IL-8R的cDNAs已從中性粒細胞中克隆并被分離，這兩種類型的受體由位于人染色體2q 34-2q3 5的單拷貝基因編碼，兩者之間cDNAs編碼的氨基酸序列約有77﹪是相同的。腫瘤發(fā)展與血管生成密不可分，自從Koch等人發(fā)現(xiàn)IL-8與血管生成有關以來，人們開始注意到IL-8與腫瘤的關系。如在胰腺癌、惡性間皮瘤、結腸癌、黑色素瘤中發(fā)現(xiàn)它可以作為自分泌生長因

7、子而促進腫瘤的發(fā)展，在前列腺癌、非小細胞肺癌、乳腺癌、子宮內膜癌、膀胱癌等腫瘤中則發(fā)現(xiàn)它可以促進腫瘤轉移，可能是通過促進膠原酶的活性、影響細胞的粘附移動及血管生成所致。但也有少數研究發(fā)現(xiàn)它具有抗腫瘤作用：Lee等人發(fā)現(xiàn)JL-8轉染的卵巢癌細胞體外試驗對細胞的生長并沒有影響，但是注入小鼠體內后則抑制了腫瘤的生長，而注入IL-8的中和抗體后腫瘤生長又恢復，認為這種抑制腫瘤生長的作用是由注射部位聚集的大量中性粒細胞及巨噬細胞介導的。而且，泰素

8、抑制卵巢腫瘤的作用與它上調IL-8表達從而誘導中性粒細胞聚集有關。已有研究發(fā)現(xiàn)肝癌細胞也可分泌IL-8，但是關于肝癌細胞是否表達IL-8R以及表達哪種受體(CXCR 1 or CXCR2)國內外尚未見報道。本研究擬就上述問題以及IL-8分泌與肝癌轉移潛能的關系、IL-8及其中和抗體對肝癌細胞增殖及侵襲能力的影響進行初步探討。 EGFR是研究最為深入的生長因子受體，約三分之一的上皮性腫瘤高表達EGFR，其中也包括乳腺癌和肝癌，其過度表達往

9、往提示腫瘤患者預后較差。EGFR可通過兩個不同的途徑活化，一個是配體依賴途徑：即配體與EGFR結合后，激活EGFR自身酪氨酸激酶活性，使胞內激酶區(qū)的數個酪氨酸位點發(fā)生自身磷酸化。EGFR的配體主要有EGF和TGF-α，還有Epiregulin、β-cellulin、HB-EGF、Amphiregulin(AR)及epigen，其自身磷酸化位置多在C末端尾部，主要位置是1173、1148和1068等位的Tvr。另一個途徑就是非配體依賴途徑

10、，也稱為轉活(transactivation)：即當受到H<,2>O<,2>、紫外線、滲透應力、乙酰膽堿受體、生長激素等刺激后EGFR發(fā)生自身磷酸化。研究發(fā)現(xiàn)GPCR配體如凝血酶、溶血磷脂酸、內皮素、I等也可誘導EGFR的轉活，提示GPCR信號通路與EGFR信號通路之間的cross-talk，作為GPCR配體之一的IL-8是否也有這種作用自然引起了人們的興趣。Schraufstatter等人發(fā)現(xiàn)IL-8可誘導內皮細胞EGFR的轉活，這一

11、過程是由CXCR2介導的并且依賴于組織蛋白酶B的活性。在胃癌及結腸癌的研究中發(fā)現(xiàn)I-．8誘導了EGFR配體HB-EGF的脫落及EGFR的酪氨酸磷酸化，這一過程是由ADAM介導的。Venkatakrishnan等人在卵巢癌中的研究發(fā)現(xiàn)IL-8誘導了與Grb2有關的一些蛋白的磷酸化，其中就包括EGFR和銜接蛋白Shc的亞型，并且EGFR的轉活依賴于細胞內Ca<'2+>濃度的增加。在乳腺癌和肝癌中是否也存在著兩種信號通路之間的cross-ta

12、lk是本研究的重點。 二、研究方法: 本研究分為兩部分：1．探討IL-8是否是肝癌的自分泌生長因子及IL-8分泌與肝癌轉移潛能的關系：采用雙抗體夾心ELISA方法檢測HepG2細胞、MHCC97-L(低轉移潛能)及MHCC97-H(高轉移潛能)三種肝癌細胞IL-8分泌的差異：免疫細胞化學方法(ICC)檢測三株癌細胞膜表面是否表達IL-8受體，以及表達哪種受體(CXCRl OrCXCR2)；MTT和matrigel inv

13、asion方法分析rhIL-8及anti-IL-8對癌細胞增殖及侵襲的影響。2．探討肝癌和乳腺癌中IL-8與EGFR信號通路之間是否存在cross-talk：ELISA方法檢測rhEGF和anti-EGFR對肝癌和乳腺癌IL-8分泌的影響；western blot方法分析rhIL-8及anti-IL-8對EGFR酪氨酸磷酸化的影響。三、研究結果1、三株肝癌細胞均有IL-8分泌；其細胞膜表面均有IL-8受體的表達，且均表達兩種受體(CXC

14、R1及CXCR2)；雖然高轉移潛能的肝癌細胞其IL-8分泌比低轉移潛能細胞多，但三組比較均未達到統(tǒng)計學差異。 2、rhIL-8及其中和抗體對三株肝癌細胞的增殖均無明顯影響，但可影響三株肝癌細胞的侵襲能力：rhIL-8可提高癌細胞的侵襲活性(P<0.05)，其中和抗體則對癌細胞的侵襲有抑制作用(P<0.05)。 3、rhEGF及anti-EGFR均抑制了乳腺癌細胞IL-8的分泌(P<0.05；P<0.01)，而rhIL-8

15、對乳腺癌細胞EGFR的活化并無明顯影響，相反anti-IL-8卻誘導了乳腺癌細胞EGFR的活化。 4、rhEGF對肝癌細胞IL-8的分泌有促進作用(P<0.05)，anti-EGFR對肝癌細胞IL-8的分泌有抑制作用(P<0.01)，而rhIL-8及anti-IL-8對肝癌細胞EGFR的活化均無明顯影響。 四、結論: 1、雖然肝癌細胞可分泌大量IL-8，也表達IL-8受體，但是IL-8并不是肝癌的自分泌生長因子，

16、IL-8的分泌與肝癌的轉移潛能也沒有關系：IL-8通過促進癌細胞的侵襲而影響肝癌的發(fā)展。 2、肝癌及乳腺癌細胞中均未發(fā)現(xiàn)IL-8可誘導EGFR的轉活，但是乳腺癌中anti-IL-8卻誘導了EGFR的轉活，提示乳腺癌中GPCR介導的IL-8信號通路與EGFR信號通路之間并無cross-talk，而是競爭抑制的關系。 3、肝癌及乳腺癌細胞中anti-EGFR均可明顯抑制IL-8的釋放，為anti-EGFR與anti-IL-