微損傷環(huán)境下干細(xì)胞移植治療骨不連的動(dòng)物試驗(yàn)研究.pdf

1、骨不連是目前骨科臨床面臨的重要難題之一，其治療方案較多，但效果不一，干細(xì)胞治療的興起為骨不連的治療從根本上提供了一種潛在的良好治療方案，有著良好的應(yīng)用前景。骨修復(fù)過程中，需要骨折部聚集數(shù)量足夠的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)。所以，向骨折骨不連部位引入足夠的MSCs是促進(jìn)骨修復(fù)的前提條件及重要的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)。由此干細(xì)胞就成為治療骨不連的理想的種子細(xì)胞。
　　干細(xì)胞

2、移植治療骨不連有著良好的臨床應(yīng)用前景，同時(shí)微損傷環(huán)境為干細(xì)胞提供龕環(huán)境，既結(jié)合了干細(xì)胞的修復(fù)功能的特性，又引入了局部微損傷的支持培養(yǎng)誘導(dǎo)分化環(huán)境。
　　目的：本試驗(yàn)以兔橈骨骨缺損骨不連模型行微損傷環(huán)境下干細(xì)胞治療，從示蹤、病理、影像、統(tǒng)計(jì)等多個(gè)方面全面反應(yīng)微損傷環(huán)境下干細(xì)胞移植治療骨不連的療效。
　　方法：動(dòng)物體內(nèi)對照試驗(yàn)。選取20只新西蘭大白兔，隨機(jī)分為兩組：試驗(yàn)組(干細(xì)胞組)和對照組(單植骨組)。抽吸兔的脛骨骨髓血，采用

3、全骨髓貼壁培養(yǎng)篩選法分離培養(yǎng)兔BMSCs。培養(yǎng)達(dá)到107數(shù)量級后以超順磁氧化鐵納米粒子(superparamagnetic iron oxide，SPIO)培養(yǎng)標(biāo)記BMSCs備用。應(yīng)用形成骨缺損法制作骨不連模型。選擇兔前肢橈骨中段，截骨長度為15mm，觀察時(shí)間為6周。造模成功后，試驗(yàn)組在局部微損傷環(huán)境下行取自體髂骨碎骨粒植骨，同時(shí)行同種異體干細(xì)胞移植術(shù)。單植骨組只行自體髂骨碎骨粒植骨。術(shù)后第1-12周分別進(jìn)行相關(guān)檢查對比觀察，包括：1.

4、大體形態(tài)學(xué)觀察；2.病理學(xué)觀察：HE染色和普魯士藍(lán)染色，反應(yīng)成骨及細(xì)胞演化情況；3.MRI動(dòng)態(tài)活體體內(nèi)干細(xì)胞跟蹤，掃描序列為：3D fsSPGRE、T2*GRE、T1 FSE。4.X線影像學(xué)的觀察：術(shù)后對試驗(yàn)兔行X線檢查，觀察橈骨骨不連的骨質(zhì)愈合及骨痂變化情況。5.利用實(shí)達(dá)PACS影像診斷工作站系統(tǒng)測量x線片各骨痂形成面積，所得2組骨痂面積對比，應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)SPSS軟件分析兩組數(shù)據(jù)，P＜0.05則認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：20只

5、新西蘭大白兔全部存活，進(jìn)入結(jié)果分析。
　　1.干細(xì)胞分離培養(yǎng)擴(kuò)增MSCs的形態(tài)學(xué)觀察：分離后梭形細(xì)胞和多角形細(xì)胞顯著增多，集落方式生長，數(shù)量逐漸增多，呈現(xiàn)長梭形、紡錘形，消化傳代擴(kuò)增純化至第3代備用，干細(xì)胞數(shù)達(dá)到107數(shù)量級。干細(xì)胞呈紡錘形和長梭形，且具有干細(xì)胞物理性貼壁粘附及集落生長的特性鑒定為兔BMSCs。
　　2.造模6周后，觀察試驗(yàn)兔全部成活良好?；贾锌谟狭己?，活動(dòng)良好，觸摸可及橈骨段缺損凹陷。X片示：橈骨中段骨

6、質(zhì)缺損無骨性連接，斷端硬化，骨髓腔封閉。
　　3.在骨不連植骨術(shù)后第1—12周分別進(jìn)行干細(xì)胞組與單純植骨組相關(guān)對比觀察。
　　3.1 大體形態(tài)學(xué)觀察：術(shù)后3周標(biāo)本觀察兩組外形差異不大。術(shù)后6周觀察干細(xì)胞組骨痂較大；單純植骨組對照側(cè)可見骨痂明顯減少，植骨碎骨粒吸收。術(shù)后8周干細(xì)胞組見骨痂明顯增大，植入碎骨粒融合，骨不連缺損愈合良好；植骨組可見骨髓腔大部封閉，肉芽組織增生。術(shù)后12周觀察干細(xì)胞組完全修復(fù)，單植骨組植骨吸收，髓腔閉

7、塞，肉芽組織填充。
　　3.2 SPIO標(biāo)記的干細(xì)胞，標(biāo)記后的BMSCs在T2WI、尤其GRE(T2*WI)序列信號明顯降低，在T1 FSE序列中片狀植骨區(qū)內(nèi)可以分辨出中等點(diǎn)狀圓形信號，提示為標(biāo)記的BMSCs的典型表現(xiàn)，能夠較好的分辨干細(xì)胞。隨著時(shí)間的推移干細(xì)胞增殖代謝致使干細(xì)胞核磁顯影逐漸降低，大約觀察時(shí)間在8周左右，表明8周內(nèi)標(biāo)記的干細(xì)胞具有活力。單植骨單植骨組無相關(guān)改變。
　　3.3 各組治療術(shù)后骨缺損不連X片成像結(jié)果

8、：術(shù)后2周干細(xì)胞組與單植骨組橈骨X線檢查無明顯差異。自第3周可以明顯看出單植骨組較干細(xì)胞組骨粒密度及面積明顯降低減少。4周后可見單植骨組骨顆粒明顯減少吸收；干細(xì)胞組在骨缺損區(qū)可見云霧狀新骨生長的改變。6周單植骨組可見骨顆粒大部分吸收，骨髓腔部分閉塞；干細(xì)胞組缺損區(qū)呈云霧狀影，骨痂豐富，骨髓腔部分再通。術(shù)后8周單植骨組缺損區(qū)無骨性連接，植骨吸收；干細(xì)胞側(cè)呈大骨痂，缺損區(qū)呈骨性連接，骨髓腔再通。術(shù)后12周單植骨組缺損區(qū)無骨性連接，斷端硬化，

9、骨髓腔封閉；干細(xì)胞組缺損區(qū)呈骨性連接，骨髓腔再通，塑性良好。
　　3.4 病理組織學(xué)：2周時(shí)兩組組織病理形態(tài)對比差異不大?？梢娎w維結(jié)締組織、大量炎性細(xì)胞聚集，可見大量死骨碎片。3周干細(xì)胞組病理切片可見大面積軟骨細(xì)胞增生活躍。單植骨組死骨數(shù)量較多，軟骨增生較差。6周時(shí)干細(xì)胞組骨粒植骨融合，可見新生類骨質(zhì)，成骨細(xì)胞增多，普魯士藍(lán)染色可見局部細(xì)胞胞內(nèi)藍(lán)染顆粒陽性的干細(xì)胞，干細(xì)胞已經(jīng)部分分化為成骨細(xì)胞；單植骨組內(nèi)有纖維結(jié)締組織長入，軟骨細(xì)

10、胞增生不明顯，成骨細(xì)胞較少，骨粒吸收減少，死骨較多，骨組織結(jié)構(gòu)紊亂，做普魯士藍(lán)染色未見到藍(lán)染顆粒。8周時(shí)干細(xì)胞組大量編織骨樣組織，可見較多成骨細(xì)胞，排列較整齊，骨結(jié)構(gòu)接近正常形態(tài)；單純植骨單植骨組可見大量肉芽組織。12周時(shí)干細(xì)胞組骨缺損完全修復(fù)。單植骨組可見肉芽組織填充，無骨性連接。
　　3.5 采集的X片圖像，采用實(shí)達(dá)PACS影像診斷工作站測量功能，分析統(tǒng)計(jì)骨缺損區(qū)域骨痂的面積變化。用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法使用 SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行