喹噁啉類藥物對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌和豬痢疾短螺旋體的抗菌作用機(jī)理.pdf

1、喹噁啉類化合物具有多種生物功能，被廣泛運(yùn)用于畜禽業(yè)，主要包括卡巴氧、喹乙醇（OLA）、乙酰甲喹、喹烯酮和喹賽多（CYA）。喹噁啉類藥物對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌均有效，尤其是在厭氧條件下抗菌效果特別好。盡管喹噁啉類藥物具有比較好的抗菌作用，但是它們的抗菌作用機(jī)制并不是很清楚。之前的研究表明，喹噁啉類藥物是通過(guò)損傷DNA來(lái)發(fā)揮抗菌作用的，但是，喹噁啉類藥物是怎樣損傷DNA的并不清楚，而且研究對(duì)象幾乎都是大腸桿菌。為了更好的闡明喹噁啉類藥

2、物的抗菌作用機(jī)理，本次實(shí)驗(yàn)選取對(duì)喹噁啉類藥物都比較敏感的兩株厭氧菌作為實(shí)驗(yàn)菌種：一株是革蘭氏陽(yáng)性菌產(chǎn)氣莢膜梭菌，一株是革蘭氏陰性菌豬痢疾短螺旋體，并選取喹賽多和喹乙醇作為喹噁啉類藥物的代表藥物進(jìn)行研究。在厭氧條件下，通過(guò)高效液相色譜儀(HPLC)分析喹賽多和喹乙醇在兩種細(xì)菌中的脫氧代謝物的種類并檢測(cè)脫氧代謝物的抗菌活性；研究喹賽多和喹乙醇對(duì)起兩株細(xì)菌的形態(tài)影響，對(duì)細(xì)菌的細(xì)胞膜、細(xì)胞壁的和染色體DNA的完整性的影響；通過(guò)熒光探針探針檢測(cè)經(jīng)

3、過(guò)喹噁啉類藥物作用后細(xì)菌體內(nèi)的活性氧自由基。本實(shí)驗(yàn)的研究能夠更好的闡述喹噁啉類藥物在厭氧條件下的抗菌作用機(jī)理，是對(duì)喹噁啉類藥物抗菌作用機(jī)制的驗(yàn)證和補(bǔ)充，有助于喹噁啉類新藥物的研發(fā)，并為喹噁啉類新藥物的臨床應(yīng)用提供更加可靠的科學(xué)依據(jù)。
　　1喹噁啉類藥物在兩株菌體內(nèi)的脫氧代謝物種類及其代謝物的抗菌活性
　　在厭氧條件下，藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明喹賽多對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌和豬痢疾短螺旋體的MIC值分別為1、0.031μg/mL，喹乙醇對(duì)產(chǎn)氣莢

4、膜梭菌和豬痢疾短螺旋體的MIC值分別為1、0.0625μg/mL，這說(shuō)明喹賽多和喹乙醇對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌和豬痢疾短螺旋體都很敏感。
　　通過(guò)HPLC分別在產(chǎn)氣莢膜梭菌CVCC1125和豬痢疾短螺旋體B204與喹賽多孵育的上清液中檢測(cè)到喹賽多的兩種脫氧代謝物（Cy1，脫二氧喹賽多；Cy2， N4脫一氧喹賽多），但是均沒(méi)有檢測(cè)到N1脫一氧喹賽多（Cy2）。用同樣的方法分別在產(chǎn)氣莢膜梭菌和豬痢疾短螺旋體與喹乙醇孵育的培養(yǎng)基上清液中檢測(cè)到喹乙

5、醇的兩種脫氧代謝物（O1，N1脫一氧喹乙醇；O2，脫二氧喹乙醇），但是沒(méi)有檢測(cè)到N4脫一氧喹乙醇（O7）。藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明喹賽多和喹乙醇的脫氧代謝物對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌和豬痢疾短螺旋體均沒(méi)有抗菌活性，這說(shuō)明喹噁啉類藥物確實(shí)是在脫氧過(guò)程中發(fā)揮抗菌作用。
　　2.喹噁啉類藥物對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌和豬痢疾短螺旋體的形態(tài)變化的影響
　　在本實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)光學(xué)顯微鏡發(fā)現(xiàn)亞抑菌濃度（1/2 MIC）喹賽多和喹乙醇處理組的產(chǎn)氣莢膜梭菌和豬痢疾短螺旋體的

6、菌體都較空白組的菌體變長(zhǎng)，呈纖維絲狀，這種現(xiàn)象可能是細(xì)菌 DNA受損后的出現(xiàn)的應(yīng)激反應(yīng)。掃描電鏡（SEM）圖表明：喹噁啉類藥物作用于產(chǎn)氣莢膜梭菌后，細(xì)菌變長(zhǎng)，表面還變得粗糙，甚至出現(xiàn)了斷裂；豬痢疾短螺旋體經(jīng)喹噁啉類藥物處理后，菌體出現(xiàn)聚集，卷曲現(xiàn)象，有些菌體甚至出現(xiàn)畸形。透射電鏡（TEM）圖表明：喹噁啉類藥物作用于產(chǎn)氣莢膜梭菌后，菌體出現(xiàn)了不均等分裂現(xiàn)象，細(xì)胞質(zhì)變得稀疏。豬痢疾短螺旋體經(jīng)喹噁啉類藥物處理后，細(xì)胞質(zhì)泄露很嚴(yán)重。
　　

7、3.喹噁啉類藥物對(duì)兩株菌的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的完整性影響
　　在本研究中，經(jīng)過(guò)喹噁啉類藥物處理的產(chǎn)氣莢膜梭菌和豬痢疾短螺旋體的培養(yǎng)液上清中的堿性磷酸酶的水平與空白組相比較有所增加，而且產(chǎn)氣莢膜梭菌上清液中的堿性磷酸酶水平比豬痢疾短螺旋體的上清液中堿性磷酸酶水平更高，這是可能是因?yàn)楫a(chǎn)氣莢膜梭菌在遇到氧化應(yīng)激后會(huì)產(chǎn)生孢子，在這個(gè)過(guò)程中，堿性磷酸酶的合成量會(huì)有所增加。
　　通過(guò)測(cè)定細(xì)胞內(nèi)的泄漏物質(zhì)在260 nm的吸光度來(lái)反映細(xì)胞膜的完

8、整性是否遭到破壞。OD260的升高象征著細(xì)胞質(zhì)中核酸的泄露，因此能夠反映細(xì)胞膜是否收到損傷。結(jié)果表明，經(jīng)過(guò)藥物處理后，細(xì)菌上清液在260 nm處的吸光度隨時(shí)間在增加，而且藥物濃度越高，OD260的升高依賴于藥物的濃度和孵育的時(shí)間。
　　4.產(chǎn)氣莢膜梭菌和豬痢疾短螺旋體內(nèi)的自由基
　　在厭氧條件下，MIC和4 MIC的喹賽多作用于產(chǎn)氣莢膜梭菌和豬痢疾短螺旋體后體內(nèi)有活性氧自由基（ROS）產(chǎn)生。藥物濃度越高，ROS水平越高。然而

9、不同濃度的喹噁啉作用于產(chǎn)氣莢膜梭菌后，ROS水平在90～120 min有所下降，與此相反，豬痢疾短螺旋體體內(nèi)的ROS水平在30 min～120 min內(nèi)處于累計(jì)狀態(tài)，這可能是由于產(chǎn)氣莢膜梭菌體內(nèi)的超氧化物氣化酶（SOD）和過(guò)氧化氫酶的清除活力更強(qiáng)引起的。
　　根據(jù)以前的報(bào)道，喹噁啉類藥物在體內(nèi)是通過(guò)酶的作用下產(chǎn)生自由基中間體從而對(duì)DNA造成損傷。厭氧條件下，這種自由基中間體可能通過(guò)化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生羥基自由基。在本實(shí)驗(yàn)中，MIC和4 M

10、IC的喹賽多作用于產(chǎn)氣莢膜梭菌后菌體內(nèi)都有羥基自由基產(chǎn)生，羥基自由基會(huì)損傷細(xì)胞膜，DNA以及內(nèi)部的呼吸系統(tǒng)，最終引起細(xì)胞壁損傷。
　　5.喹噁啉類藥物誘導(dǎo)的兩株菌的染色體DNA損傷
　　8-羥基脫氧鳥(niǎo)苷酸（8-OHdG）水平是DNA遭到氧化性損傷程度的標(biāo)志物，本實(shí)驗(yàn)中，喹噁啉類藥物作用后的產(chǎn)氣莢膜梭菌和豬痢疾短螺旋體內(nèi)的8-OHdG水平跟空白組相比較，明顯升高，說(shuō)明藥物作用后這兩株菌體內(nèi)的染色體 DNA受到了氧化性損傷。而8

11、-OHdG的形成又會(huì)導(dǎo)致DNA的斷裂，染色體DNA斷裂可以通過(guò)瓊脂糖凝膠顯示。瓊脂糖凝膠電泳圖顯示經(jīng)過(guò)藥物處理后的兩株菌的DNA均有拖尾和彌散現(xiàn)象，這說(shuō)明染色體DNA出現(xiàn)了降解和斷裂。除此之外，豬痢疾短螺旋體的基因組中發(fā)現(xiàn)了片段大小為6～8kb的條帶，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，這可能是豬痢疾短螺旋體內(nèi)被誘導(dǎo)的前噬菌體VSH-1。
　　總之，在厭氧條件下，喹噁啉類藥物是具有厭氧選擇活性的還原性DNA損傷劑，通過(guò)藥物代謝過(guò)程中產(chǎn)生的ROS和羥基自

12、由基不僅僅可以造成DNA的氧化性損傷而且還會(huì)造成細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的損傷，從而最終導(dǎo)致細(xì)菌死亡。本實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了喹噁啉類藥物在無(wú)氧環(huán)境更有利于喹噁啉類藥物代謝過(guò)程中自由基的有效產(chǎn)生，而且喹噁啉藥物對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌的抗拒能作用機(jī)制是相似的。
　　而不同濃度的喹噁啉作用于產(chǎn)氣莢膜梭菌后，ROS水平在90～120 min有所下降，與此相反，豬痢疾短螺旋體體內(nèi)的ROS水平在30 min～120 min內(nèi)處于累計(jì)狀態(tài)，這可能是由于產(chǎn)氣莢

13、膜梭菌體內(nèi)的超氧化物氣化酶（SOD）和過(guò)氧化氫酶的清除活力更強(qiáng)引起的。
　　根據(jù)以前的報(bào)道，喹噁啉類藥物在體內(nèi)是通過(guò)酶的作用下產(chǎn)生自由基中間體從而對(duì)DNA造成損傷。厭氧條件下，這種自由基中間體可能通過(guò)化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生羥基自由基。在本實(shí)驗(yàn)中，MIC和4 MIC的喹賽多作用于產(chǎn)氣莢膜梭菌后菌體內(nèi)都有羥基自由基產(chǎn)生，羥基自由基會(huì)損傷細(xì)胞膜，DNA以及內(nèi)部的呼吸系統(tǒng)，最終引起細(xì)胞壁損傷。
　　5.喹噁啉類藥物誘導(dǎo)的兩株菌的染色體DNA損

14、傷
　　8-羥基脫氧鳥(niǎo)苷酸（8-OHdG）水平是DNA遭到氧化性損傷程度的標(biāo)志物，本實(shí)驗(yàn)中，喹噁啉類藥物作用后的產(chǎn)氣莢膜梭菌和豬痢疾短螺旋體內(nèi)的8-OHdG水平跟空白組相比較，明顯升高，說(shuō)明藥物作用后這兩株菌體內(nèi)的染色體 DNA受到了氧化性損傷。而8-OHdG的形成又會(huì)導(dǎo)致DNA的斷裂，染色體DNA斷裂可以通過(guò)瓊脂糖凝膠顯示。瓊脂糖凝膠電泳圖顯示經(jīng)過(guò)藥物處理后的兩株菌的DNA均有拖尾和彌散現(xiàn)象，這說(shuō)明染色體DNA出現(xiàn)了降解和斷裂。

15、除此之外，豬痢疾短螺旋體的基因組中發(fā)現(xiàn)了片段大小為6～8kb的條帶，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，這可能是豬痢疾短螺旋體內(nèi)被誘導(dǎo)的前噬菌體VSH-1。
　　總之，在厭氧條件下，喹噁啉類藥物是具有厭氧選擇活性的還原性DNA損傷劑，通過(guò)藥物代謝過(guò)程中產(chǎn)生的ROS和羥基自由基不僅僅可以造成DNA的氧化性損傷而且還會(huì)造成細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的損傷，從而最終導(dǎo)致細(xì)菌死亡。本實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了喹噁啉類藥物在無(wú)氧環(huán)境更有利于喹噁啉類藥物代謝過(guò)程中自由基的有效產(chǎn)生，而且喹噁啉