喹噁啉類藥物誘導大腸桿菌產(chǎn)生自由基的機制研究.pdf

1、喹噁啉-1，4-氮二氧類藥物（以下簡稱喹噁啉類藥物）是一類化學合成的抗菌藥物，抗菌效果良好，可提高進食效率促進機體生長，在世界范圍內有著非常廣泛的應用。然而喹噁啉類藥物是如何發(fā)揮其抗菌作用的，抗菌作用又是通過何種方式進行的仍未清晰，有文獻報道喹噁啉類藥物在作用細菌后在代謝酶作用下，活化形成藥物自由基中間體，藥物自由基可能會導致DNA斷裂(Suter et al.，1978; Ganley et al.，2001;Chowdhury et

2、 al.，2004)。本實驗室前期研究表明厭氧條件下，細菌在喹賽多作用之后，產(chǎn)生了大量的ROS(reactive oxygen species，氧自由基)，同時細菌DNA出現(xiàn)損傷斷裂(張宏飛，2012)， SOS反應相關基因和蛋白表達升高數(shù)倍(李貝，2012)。這說明大腸桿菌在喹賽多作用之后產(chǎn)生了自由基，并出現(xiàn)了嚴重的DNA損傷的情況，然而DNA損傷以及藥物抗菌作用是否與自由基有關系，自由基是如何產(chǎn)生的，這些問題需要進一步研究分析。因此

3、本課題主要通過研究自由基的結構、規(guī)律和生成機制，來分析藥物抗菌作用與自由基之間的關系。本實驗選用對喹賽多敏感的大腸桿菌CVCC2943作為實驗菌株，實驗所選藥物綜合考慮藥物敏感性、臨床使用等多方面，選擇了喹賽多、乙酰甲喹喹乙醇進行實驗。實驗內容分為兩部分，一部分是對大腸桿菌CVCC2943在喹噁啉藥物作用之后的自由基的性質規(guī)律等進行了測定，包括ROS和超氧自由基的產(chǎn)生規(guī)律以及藥物自由基結構的鑒定;另一部分則是對自由基的產(chǎn)生機制進行了闡述

4、，分為藥物自由基的產(chǎn)生機制和呼吸鏈產(chǎn)生自由基兩種途徑，并對篩選出來的關鍵代謝酶進行了驗證。
　　1.喹噁啉類藥物作用細菌后的自由基的檢測
　　首先本研究對喹噁啉類藥物在有氧條件和厭氧條件下對大腸桿菌CVCC2943的MIC(最小抑菌濃度)以及MBC(最小殺菌濃度)進行了測定，以此作為后續(xù)實驗的劑量參考。對細菌在乙酰甲喹、喹乙醇作用后產(chǎn)生的自由基進行了檢測，在有氧條件下測定細菌體內的超氧自由基，厭氧條件下測定細菌的ROS，并對

5、喹賽多和乙酰甲喹在不同的作用方式下產(chǎn)生的藥物自由基結構進行了測定。
　　對喹噁啉類藥物的MIC和MBC測定顯示，喹噁啉類藥物都具有非常明顯的厭氧選擇活性，在厭氧條件下，大部分喹噁啉類藥物有比較良好的殺菌能力，但在有氧條件下，其抗菌活性明顯降低。在本實驗中，喹烯酮對大腸桿菌CVCC2943的敏感性較差，MIC大于64μg/ml，故棄去不做后續(xù)測試。
　　在張宏飛(2012)的研究中發(fā)現(xiàn)，喹賽多在厭氧條件下產(chǎn)生的ROS在1h左右

6、達到最高點后緩慢下降。而本課題的測試中發(fā)現(xiàn)，喹乙醇和乙酰甲喹均在30 min左右達到峰值然后隨時間緩慢下降，這說明喹噁啉類藥物有著相似的自由基產(chǎn)生規(guī)律。
　　另外本課題對厭氧條件下喹噁啉類藥物誘導產(chǎn)生的自由基通過電子自旋共振波譜儀進行了測定，在細菌與藥物孵育的情況，沒有檢測到單獨的電子自旋信號，而通過細菌蛋白液、黃嘌呤氧化酶、低亞硫酸鈉的還原活化下，檢測到了三重峰的自由基信號。峰之間的間隙約為10G，通過模擬并與文獻對比分析，該自

7、由基可能是藥物自由基和質子化的藥物自由基的混合物。
　　2.自由基產(chǎn)生途徑的研究
　　喹噁啉類藥物作用細菌后引起了自由基的生成，其自由基的產(chǎn)生方式可能為兩種:一是藥物通過代謝酶的活化形成藥物自由基，對DNA以及其他物質造成損傷，二是在藥物自由基對細菌造成損傷后，引起菌體發(fā)生應激反應，呼吸鏈紊亂，生成ROS等自由基。首先是對藥物自由基形成的機制進行研究，藥物自由基可以在厭氧條件下通過代謝酶還原活化形成，本實驗利用不同的代謝酶抑

8、制劑對代謝酶進行阻斷，通過細菌計數(shù)、自由基以及代謝物的檢測來確定相關代謝酶是否影響了藥物的抗菌活性。本課題選擇了黃嘌呤氧化酶(xanthine oxidase，XOR)、醇脫氫酶(alcoholdehydrogenase，ADH)、醛脫氫酶(aldehyde oxidase，AOX)、硫辛酰胺脫氫酶(diaphorase)、尿酸脫氫酶(uricase)、硫氧還原蛋白(thioredoxin reductase)等多種代謝酶作為候選對象。

9、最終確定XOR、含鐵的酶類對喹噁啉類的活化有影響，通過疊氮化鈉的抑制發(fā)現(xiàn)細胞色素類型的氧化酶以及過氧物酶參與了喹噁啉的代謝。代謝酶篩選之后，本課題對XOR進行了一系列的測定，包括:有氧條件下超氧自由基的測定、藥物自由基的檢測、代謝物的檢測、對DNA損傷的檢測等，發(fā)現(xiàn)XOR可以代謝藥物產(chǎn)生自由基，并導致DNA斷裂。
　　呼吸鏈自由基的測定，我們選擇電子鏈阻斷劑對呼吸鏈進行阻斷，從而減少呼吸鏈的“漏電子”情況，防止電子受體氧化不完全形

10、成自由基。在本實驗中選擇了二巰基丙醇以及魚藤酮兩種阻斷劑對呼吸鏈進行阻斷，繼而分析在藥物作用后細菌內的ROS是不是產(chǎn)生了變化，從而確定呼吸鏈的自由基和藥物作用后的ROS之間的關系。本研究中發(fā)現(xiàn)在藥物作用后，細菌產(chǎn)生的ROS中有一部分可能是源自呼吸鏈自由基。
　　綜上所述，喹噁啉類藥物在作用細菌后引起自由基的產(chǎn)生;在有氧條件下，喹噁啉作用后細菌引起了超氧自由基的生成;在厭氧條件下，在喹噁啉類藥物作用之后引起了細菌體內的ROS產(chǎn)生，并