萜類(lèi)小分子及金屬銅的抗真菌活性研究.pdf

1、近年來(lái)，以念珠菌為主的深部真菌感染的發(fā)病率和病死率逐年上升。真菌耐藥性的出現(xiàn)和迅速蔓延，降低了傳統(tǒng)抗真菌藥物的治療效果，使得臨床真菌感染治療面臨嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。因此開(kāi)發(fā)新型抗真菌藥物，并積極尋找新的克服真菌感染和耐藥的有效策略，是當(dāng)今抗真菌感染研究的重要任務(wù)。
　　苔蘚植物廣泛分布于自然界，生命力頑強(qiáng)，作為傳統(tǒng)的藥用資源，近年來(lái)已從中篩選出很多具有較好抗真菌活性的化合物。萜類(lèi)是苔蘚植物中被發(fā)現(xiàn)種類(lèi)最多的化學(xué)成分，生物活性廣泛，具有重要

2、的應(yīng)用價(jià)值。我們采用最低抑菌濃度篩選模型，對(duì)本課題組所建化合物庫(kù)中的106個(gè)萜類(lèi)小分子進(jìn)行了初步篩選，從中發(fā)現(xiàn)了5個(gè)具有較好抗真菌活性的小分子化合物，包括3個(gè)倍半萜類(lèi)和2個(gè)二萜類(lèi)小分子，對(duì)白色念珠菌的最低抑菌濃度均小于128 ug/ml。其中，從多苞裂萼苔Chiloscyphus polyanthus和白葉鞭苔Bazzania albifolia中均分離得到一種重排草蒲烯烷型倍半萜chiloscyphenol A(CA)，該小分子抗真菌

3、活性強(qiáng)、儲(chǔ)存量多，用于開(kāi)展更深入的抗真菌活性研究。
　　經(jīng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，CA對(duì)五種念珠菌均表現(xiàn)出殺菌活性，最低抑菌濃度為8～32ug/ml，并且能有效抑制被膜的形成，對(duì)成熟被膜也具有一定的清除作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在CA作用下，白色念珠菌的線粒體膜電勢(shì)和ATP含量發(fā)生顯著改變，線粒體外膜蛋白Tom70呈異常分布，并伴有ROS的生成，過(guò)度累積的ROS進(jìn)一步對(duì)線粒體和其他細(xì)胞結(jié)構(gòu)造成氧化損傷。此外，采用熒光染色，透射電子顯微鏡(TEM)觀察

4、，以及鈣黃綠素釋放實(shí)驗(yàn)等多種方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，CA處理后的白色念珠菌細(xì)胞膜受到嚴(yán)重?fù)p傷，通透性增加。細(xì)胞形態(tài)皺縮的現(xiàn)象則進(jìn)一步確證了CA對(duì)細(xì)胞膜的破壞作用。因此我們推斷，CA通過(guò)損傷線粒體和破壞細(xì)胞膜發(fā)揮抗真菌作用。
　　銅表面具有廣泛的抑制或殺滅病原體的作用，將銅及銅合金應(yīng)用到臨床，是真菌感染防治的一個(gè)新思路。已有研究顯示，銅及銅合金能在90 min內(nèi)殺滅全部的浮游態(tài)白色念珠菌。本研究通過(guò)測(cè)定時(shí)間-殺菌曲線，發(fā)現(xiàn)金屬銅對(duì)白色念珠菌成

5、熟被膜也具有很好的殺菌效果。離子釋放實(shí)驗(yàn)顯示，銅片釋放的銅離子濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于硫酸銅的有效作用濃度，說(shuō)明銅自身釋放的銅離子并非銅表面接觸殺菌的決定性因素。通過(guò)熒光染色觀察發(fā)現(xiàn)，在銅片的作用下，白色念珠菌被膜細(xì)胞內(nèi)ROS迅速累積，并在一定時(shí)間內(nèi)呈時(shí)間依賴(lài)性。此外，我們還發(fā)現(xiàn)被膜形成相關(guān)基因ALS1、ALS3的突變株所形成的被膜更加耐受銅片的清除作用。采用FDA/PI染色觀察，未發(fā)現(xiàn)被膜內(nèi)的細(xì)胞形態(tài)與細(xì)胞死活狀態(tài)相關(guān)。另外，電感耦合等離子體發(fā)射

6、光譜儀(ICP-AES)分析結(jié)果顯示，ALS突變株胞內(nèi)銅離子濃度顯著低于野生株。CRP1和CUP1是白色念珠菌細(xì)胞內(nèi)與銅穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)相關(guān)基因，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，銅作用后，ALS突變株的CUP1表達(dá)量無(wú)明顯變化，而CRP1的表達(dá)量顯著增加。綜上所述，我們推測(cè)，銅表面與白色念珠菌被膜接觸后，能在接觸部位產(chǎn)生高濃度銅離子而損壞細(xì)胞膜，大量銅離子緊接著涌入細(xì)胞內(nèi)，誘導(dǎo)ROS的累積，引起氧化損傷從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡，而Als1和Als3蛋白能通過(guò)抑制銅離子外排泵

7、CRP1的表達(dá)促進(jìn)該過(guò)程。
　　本論文通過(guò)篩選，得到了5個(gè)具有抗真菌活性的萜類(lèi)小分子，并以CA作為代表，闡述了倍半萜類(lèi)天然產(chǎn)物的抗真菌活性及其作用機(jī)制，為開(kāi)發(fā)倍半萜作為新型抗真菌藥物提供了理論依據(jù)，也為今后研究其他倍半萜類(lèi)化合物的抗真菌機(jī)制提供了一個(gè)很好的思路。此外，我們還確證了金屬銅的抗真菌作用，第一次深入研究了金屬銅對(duì)白色念珠菌生物被膜的清除效果，并發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)與被膜耐受銅相關(guān)的基因ALS1和ALS3，為推進(jìn)銅材料在臨床上的應(yīng)用