黃芪甲苷對(duì)缺血再灌注損傷后血腦屏障的預(yù)保護(hù)作用機(jī)制研究.pdf

1、研究背景：
　　腦缺血是60歲以上最常見(jiàn)第二大死亡因素、第二大癡呆病因，并且在高收入國(guó)家中，中風(fēng)占到醫(yī)療健康預(yù)算的3％-7％。隨著我國(guó)老年化人口不斷增加，近年來(lái)腦缺血的患病人數(shù)在持續(xù)遞增，腦缺血成為我國(guó)最重要的公共衛(wèi)生問(wèn)題之一。
　　長(zhǎng)期以來(lái)，人們一直認(rèn)為只要及時(shí)恢復(fù)供血，就能將缺血引發(fā)的損傷降到最低。然而這一理論在20世紀(jì)70年代受到質(zhì)疑。有研究認(rèn)為，對(duì)缺氧組織突然恢復(fù)供氧，會(huì)導(dǎo)致一種獨(dú)特的損傷反應(yīng)產(chǎn)生，并且不同于低氧狀態(tài)

2、下的損傷反應(yīng)。因此，缺血再灌注損傷被發(fā)現(xiàn)，迅速發(fā)展成為一個(gè)新的研究領(lǐng)域。腦缺血再灌注損傷是指腦組織缺血、缺氧一定時(shí)間后造成了組織損傷，但積極治療恢復(fù)腦部血供后，腦損傷程度非但沒(méi)減輕反而加重，出現(xiàn)了更為嚴(yán)重的腦功能障礙，甚至引起多器官損傷的現(xiàn)象。但目前對(duì)腦缺血的治療，臨床共識(shí)依然是盡快恢復(fù)供血，減輕腦組織缺血程度。因此，再灌注損傷無(wú)法避免，而對(duì)于減少再灌注損傷的治療，臨床上缺少有效的治療藥物。所以研究減少再灌注損傷的治療具有重要臨床意義。

3、
　　黃芪甲苷是一種從黃芪上提取出來(lái)的單體?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，黃芪具有多種藥用價(jià)值，如抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗癌、抗糖尿病、心肌保護(hù)、保肝、抗病毒功能等。研究顯示，黃芪甲苷具有很好的腦保護(hù)作用，能通過(guò)抑制缺血后半暗帶區(qū)的外周型苯二氮卓受體的表達(dá)，減少半暗帶區(qū)面積，保護(hù)腦組織。還能顯著改善雙側(cè)頸總動(dòng)脈閉塞小鼠的記憶障礙和神經(jīng)炎癥，機(jī)制是降低TLR4及其下游受體蛋白的表達(dá)，包括MyD88、TRIF和TRAF6，并且抑制NF-κ B

4、的磷酸化。還有一些研究表明，黃芪甲苷對(duì)缺血再灌注大腦的保護(hù)，是由于能改善血腦屏障的功能，降低血腦屏障在病理狀態(tài)下的通透性。
　　在本實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)黃芪甲苷能通過(guò)抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和減少線粒體損傷，減少腦血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡，從而保護(hù)血腦屏障的結(jié)構(gòu)和功能，達(dá)到保護(hù)腦組織和減少梗死面積的作用。
　　實(shí)驗(yàn)一:黃芪甲苷對(duì)MCAO大鼠的血腦屏障的預(yù)保護(hù)作用研究
　　目的:
　　研究黃芪甲苷在大腦缺血再灌注后對(duì)血腦屏障的預(yù)保護(hù)作

5、用，并測(cè)定內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白，以確定其機(jī)制。
　　方法:
　　SPF級(jí)SD雄性大鼠140只，年齡在6周左右。隨機(jī)將大鼠分為5個(gè)組。采取的給藥方式為造模前灌胃給藥3周。用線栓法造大鼠腦缺血再灌注模型，缺血2h，再灌注24h。再灌注結(jié)束后，檢測(cè)TTC、伊文氏藍(lán)、HE染色、尼氏染色、SOD、MDA、蛋白電泳檢測(cè)相關(guān)蛋白。
　　結(jié)果:
　　1.神經(jīng)功能缺損評(píng)分
　　采用Longa's的5級(jí)標(biāo)準(zhǔn)評(píng)分法評(píng)分，除sham

6、組外，其余四組動(dòng)物評(píng)分無(wú)明顯差異。
　　2.TTC染色實(shí)驗(yàn)
　　vehicle組大鼠的梗死面積明顯多于其他幾組(sham組:p=0.002，其他幾組:p＜0.05)，且三個(gè)用藥組梗死面積均明顯少于vehicle組差異有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(ASL: p=0.018; ASM: p=0.006; ASH: p=0.003)。
　　3.伊文氏藍(lán)染色實(shí)驗(yàn)
　　直接顯微鏡鏡下觀察，vehicle組大鼠右側(cè)大腦較其他組顏色更深

7、。vehicle組大鼠梗死側(cè)大腦中伊文氏藍(lán)的含量，顯著高于假手術(shù)組(p＜0.001)和用藥組(ASL:p=0.010; ASM:p=0.001; ASH:p＜0.001)。比較左側(cè)大腦，這5個(gè)組伊文氏藍(lán)含量沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＞0.05)。
　　4.HE染色結(jié)果
　　sham組顯示腦組織皮質(zhì)結(jié)構(gòu)正常，細(xì)胞完整，胞漿豐富，核仁清晰。而vehicle組和用藥組大鼠梗死側(cè)皮質(zhì)HE染色結(jié)果顯示，梗死側(cè)大腦皮質(zhì)出現(xiàn)經(jīng)典梗死病理改變（梗死

8、區(qū)域可見(jiàn)固縮壞死神經(jīng)元，細(xì)胞數(shù)量少，呈嗜伊紅染色）。而各用藥組與vehicle組比較，細(xì)胞損傷減輕，嗜伊紅染色也相對(duì)減少。
　　5.尼氏染色結(jié)果
　　sham組顯示大腦皮質(zhì)尼氏小體排列整齊，數(shù)量多。而vehicle組大鼠的梗死側(cè)皮質(zhì)尼氏小體排列稀疏，數(shù)目明顯減少。與vehicle組相比，各用藥組梗死側(cè)皮質(zhì)尼氏小體損傷較輕，排列較整齊，數(shù)量較多。
　　6.黃芪甲苷對(duì)梗死側(cè)大腦SOD與MDA的影響
　　vehicle

9、組大鼠右側(cè)大腦的SOD水平明顯減少(p＜0.001)，MDA的水平卻顯著提高(p＜0.001)。AS能提高大鼠大腦缺血再灌注損傷區(qū)域的SOD活性(ASL: p=0.040;ASM:p=0.014; ASH:p=0.001)，并降低MDA的水平(ASL: p=0.001; ASM: p=0.001;ASH: p＜0.001)。
　　7.黃芪甲苷對(duì)血液中SOD與MDA的影響
　　AS低中高各組與vehicle組相比較，血中MDA

10、水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(ASLp=0.909，ASM p=0.924，ASH p=0.902)。vehicle組大鼠血液中的SOD活力比sham組低(p=0.008)。各用藥組中，只有AS10uM組血液中SOD活力比vehicle組高(p=0.041)。其余兩組與vehicle組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(ASL p=0.253，ASMp=0.065)。
　　8.黃芪甲苷對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白的影響
　　vehicle組大鼠腦血管內(nèi)

11、皮細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生較高水平的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(BIP: p=0.001;CHOP: p=0.025; P-PERK/PERK: p＜0.001; P-eif2α/eif2α:p=0.003)。AS能抑制BIP、CHOP、P-PERK和P-eif2α蛋白的表達(dá)，與vehicle組大鼠相比，差異有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(BIP:ASL p=0.038，ASM p=0.015，ASH p=0.014; CHOP:ASL p=0.029，ASM p=0.019，

12、ASH p=0.007; P-PERK/PERK: ASL p=0.039，ASM p=0.028，ASH p=0.004;P-eif2α/eif2α:ASL p=0.039，ASM p=0.026，ASH p=0.006)。
　　9.黃芪甲苷的抗細(xì)胞凋亡作用
　　vehicle組腦血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生較高水平的Bax蛋白表達(dá)，Bcl-2蛋白表達(dá)受到抑制(p＜0.001)。AS能明顯改善缺血再灌注大腦的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，與vehi

13、cle組大鼠相比，差異有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(ASL p=0.047，ASM p=0.037，ASH p=0.002)。
　　vehicle組腦血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生較高水平的caspase-3蛋白表達(dá)(p＜0.001)。AS能明顯減少缺血再灌注大腦的內(nèi)皮細(xì)胞caspase-3蛋白表達(dá)，與vehicle組大鼠相比，差異有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(ASL p=0.045，ASM p=0.031，ASH p=0.011)。
　　實(shí)驗(yàn)二:黃芪甲苷

14、對(duì)缺糖缺氧再?gòu)?fù)糖復(fù)氧模型(OGD/R)內(nèi)皮細(xì)胞的預(yù)保護(hù)作用研究
　　目的:
　　研究黃芪甲苷抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和減少線粒體損傷對(duì)缺糖缺氧再?gòu)?fù)糖復(fù)氧模型內(nèi)皮細(xì)胞的預(yù)保護(hù)作用。
　　方法:
　　小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞BMECs，分為CON組、OGD/R組、OGD/R+AS2.5uM組、OGD/R+AS5uM組、OGD/R+AS10uM組。待造模結(jié)束后，檢測(cè)MTT、SOD、MDA、蛋白電泳檢測(cè)相關(guān)蛋白、ATP、JC-1。

15、r>　　結(jié)果:
　　1.黃芪甲苷對(duì)正常內(nèi)皮細(xì)胞以及OGD/R誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷的影響
　　采用MTT法檢測(cè)，黃芪甲苷對(duì)正常內(nèi)皮細(xì)胞未顯示毒性。在AS預(yù)保護(hù)24h后，缺糖缺氧4h再?gòu)?fù)糖復(fù)氧4h，結(jié)果顯示，AS2.5 uM(p=0.044)和5 uM(p=0.008)以及10 uM(p=0.002)對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞具有良好的預(yù)保護(hù)作用，其中10uM濃度藥效最穩(wěn)定。
　　2.黃芪甲苷對(duì)OGD/R誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)SOD活性和MDA水

16、平的影響
　　OGD/R組與CON組相比，MDA水平較高，SOD活性下降，差異有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p=0.002)。AS能降低MDA水平，增加SOD的活力。但在降低MDA水平方面只有OGD/R+AS5uM組和OGD/R+AS10uM組顯示出統(tǒng)計(jì)學(xué)上的差異(AS5 p=0.019，AS10p=0.011);且在增加SOD活力方面，只有OGD/R+AS10uM組顯示出統(tǒng)計(jì)學(xué)上的差異(AS10 p=0.01)。
　　3.黃芪甲苷對(duì)

17、凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響
　　OGD/R組與CON組相比，Bcl-2蛋白表達(dá)下調(diào)，Bax蛋白表達(dá)上調(diào)，差異有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p=0.005)。AS能明顯增加Bcl-2蛋白的表達(dá)，減少Bax蛋白表達(dá)(AS2.5p=0.047，AS5 p=0.019，AS10 p=0.011)。
　　OGD/R組與CON組相比，caspase-3蛋白表達(dá)上調(diào)，差異有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p=0.003)。AS能明顯減少caspase-3蛋白表達(dá)(A

18、S2.5 p=0.034，AS5 p=0.015，AS10 p=0.012)。AS能起到明顯的抗凋亡作用。
　　4.黃芪甲苷對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白表達(dá)的影響
　　OGD/R組與CON組相比，BIP、CHOP、P-PERK和P-eif2α蛋白的表達(dá)均較高(BIP:p=0.006; CHOP: p=0.008; P-PERK/PERK: p=0.028; P-eif2α/eif2α: p=0.003)。AS能明顯緩解內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)的內(nèi)

19、質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(BIP: AS2.5 p=0.039，AS5 p=0.012，AS10p=0.012; CHOP: AS2.5 p=0.039，AS5 p=0.032，AS10 p=0.027; P-PERK/PERK:AS2.5 p=0.048，AS5 p=0.015，AS10 p=0.008; P-eif2α/eif2α:AS2.5 p=0.033,AS5 p=0.009，AS10 p=0.005)
　　5.黃芪甲苷內(nèi)皮細(xì)胞的ATP

20、影響
　　OGD/R組與CON組相比，ATP含量明顯減少(p＜0.001)。AS10uM組能明顯提高ATP的含量(p=0.005)。而AS2.5uM和AS5uM組與OGD/R組相比，有趨勢(shì)但沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的差異(p=0.610; p=0.218)。
　　6.黃芪甲苷對(duì)線粒體膜電位的影響
　　通過(guò)熒光倒置顯微鏡觀察，OGD/R組與CON組相比，綠色熒光明顯增多，說(shuō)明MMP下降明顯。AS2.5uM、AS5uM組和AS10uM

21、組，與OGD/R組相比較，紅色熒光較多，說(shuō)明AS能顯著提高線粒體MMP的水平，改善線粒體功能。
　　通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行定量分析，OGD/R組與CON組相比，MMP水平明顯下降(p＜0.001)。AS10uM組能明顯緩解MMP的下降，改善線粒體功能(p=0.002)。而AS2.5uM和AS5uM組與OGD/R組相比，有趨勢(shì)但沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的差異(p=0.148; p=0.09)
　　結(jié)論:
　　(1)黃芪甲苷能上調(diào)Bcl-

22、2的表達(dá)，并下調(diào)Bax和caspase-3的表達(dá)，有效減少缺血再灌注導(dǎo)致的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。
　　(2)黃芪甲苷能下調(diào)BIP、CHOP、P-PERK和P-eif2α蛋白的表達(dá)，抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。
　　(3)黃芪甲苷能增加ATP的含量，提高線粒體膜電位，有效的減少缺血再灌注對(duì)線粒體的損傷。
　　(4)黃芪甲苷能有效的保護(hù)血腦屏障，減少腦梗死的面積，達(dá)到保護(hù)大腦神經(jīng)的作用。
　　(5)黃芪甲苷能通過(guò)有效減少線粒體的損傷，并