去泛素化酶USP48調(diào)節(jié)TNFα信號轉(zhuǎn)導通路中TRAF2蛋白穩(wěn)定性的研究.pdf

1、背景:
　　在急性炎癥或者全身炎性反應(yīng)時，腫瘤壞死因子α(Tumor necrosis factorα，TNFα)的表達升高伴隨著組織器官上皮完整性的破壞，進而導致間隙增大，通透性增加，蛋白和液體滲漏，嚴重時引起器官功能障礙。在細胞水平，腫瘤壞死因子α可以使E-鈣黏蛋白表達下降。E-鈣黏蛋白的下調(diào)或缺失，降低細胞與細胞之間粘附的程度，進而導致上皮細胞的通透性和細胞活動性的增加。深入了解E-鈣黏蛋白調(diào)節(jié)的分子機制，有助于提高對上皮屏

2、障功能障礙引起的疾病的認識。腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子2(Tumor necrosis factor receptor-associated factor2，TRAF2)是一種重要的接頭蛋白，參與腫瘤壞死因子α介導的信號級聯(lián)反應(yīng)，并發(fā)揮重要作用。TRAF2在腫瘤壞死因子α的刺激后能夠募集到TNFR1或者TNFR2，調(diào)節(jié)NF-κB和c-Jun N terminal kinase(JNK)信號級聯(lián)反應(yīng)的激活。JNK參與調(diào)節(jié)E-鈣黏蛋白介導的細

3、胞粘附連接已經(jīng)被報道，但是TRAF2是否參與調(diào)節(jié)E-鈣黏蛋白的表達尚無闡述。研究表明，泛素化修飾參與調(diào)節(jié)TRAF2的活性，但是哪種去泛素化酶能夠調(diào)節(jié)TRAF2蛋白穩(wěn)定性還需探索。最近有研究表明，去泛素化酶USP48，也稱做USP31，能夠與TRAF2蛋白相互結(jié)合，但是否影響TRAF2蛋白的活性和穩(wěn)定性還尚無論證。目前USP48的生理功能還不是很明確，但其廣泛表達于各種組織器官中，提示可能參與多種必需的去泛素化過程。因此本課題擬深入研究去

4、泛素化酶USP48和TRAF2結(jié)合的生理意義及其是否影響下游信號轉(zhuǎn)導通路。
　　方法:
　　1.通過免疫印跡法明確US48對TRAF2蛋白水平的影響;通過實時熒光定量PCR檢測USP48對TRAF2mRNA水平的影響。
　　2.通過細胞內(nèi)泛素分析檢測USP48對TRAF2泛素化的影響;通過免疫共沉淀明確USP48和TRAF2的相互結(jié)合;通過免疫染色明確USP48和TRAF2的細胞內(nèi)定位。
　　3.通過免疫沉淀反應(yīng)

5、檢測TNFα和GSK3β使USP48發(fā)生磷酸化;通過免疫共沉淀明確USP48和GSK3β的相互結(jié)合;通過免疫染色明確USP48和GSK3β的細胞內(nèi)定位。
　　4.通過免疫印跡法明確GSK3β對TRAF2蛋白水平表達的影響;通過細胞內(nèi)泛素分析檢測GSK3β對TRAF2泛素化的影響。
　　5.通過體外合成系統(tǒng)合成重組的USP48野生型和突變型蛋白;通過體外去泛素化酶活性分析試劑盒檢測USP48對K-48多聚泛素鏈的水解能力。

6、r>　　6.通過免疫印跡法明確USP48、JNK、TNIK對E-鈣黏蛋白蛋白水平的影響;通過實時熒光定量PCR檢測USP48、JNK、TNIK對E-鈣黏蛋白mRNA水平的影響。
　　7.通過細胞-基質(zhì)電阻抗測量技術(shù)檢測USP48、JNK、TNIK對跨上皮細胞電阻抗值的影響。
　　結(jié)果:
　　1.USP48能夠使TRAF2蛋白穩(wěn)定。
　　1)通過轉(zhuǎn)染SiRNA敲降USP48或轉(zhuǎn)染USP48C98S-V5質(zhì)粒抑制US

7、P48催化活性可明顯減少TRAF2蛋白水平;
　　2)敲降USP48對TRAF2mRNA水平無影響;
　　3)過表達USP48延長TRAP2蛋白的半衰期。
　　2.USP48去泛素化TRAF2發(fā)生在細胞質(zhì)。
　　1)通過轉(zhuǎn)染USP48-V5質(zhì)粒過表達USP48能夠減少TRAF2蛋白的泛素化水平;
　　2)抑制USP48活性增加TRAF2蛋白的泛素化水平;
　　3)敲降USP48增加TRAF2蛋白K-4

8、8位點的多聚泛素化水平;
　　4)USP48和TRAF2在細胞質(zhì)中有共同定位。
　　3.GSK3β調(diào)節(jié)TNFα介導的USP48磷酸化。
　　1)TNFα和GSK3β可以使USP48發(fā)生磷酸化;
　　2)USP48結(jié)構(gòu)域內(nèi)含有GSK3β的磷酸化區(qū)域;
　　3)抑制GSK3β能夠抑制TNFα介導的USP48磷酸化;
　　4)USP48和GSK3β在細胞質(zhì)有共同定位。
　　4.USP48磷酸化有利于T

9、RAF2蛋白穩(wěn)定。
　　1)抑制GSK3β促進TRAF2蛋白降解;
　　2)抑制GSK3β促進TRAF2蛋白泛素化;
　　3)過表達GSK3βS9A減弱TRAF2蛋白泛素化;
　　4)過表達USP48磷酸化位點失活質(zhì)粒降低TRAF2蛋白穩(wěn)定性;
　　5)過表達USP48磷酸化位點失活質(zhì)粒增加TRAF2蛋白泛素化。
　　5.GSK3β磷酸化USP48增強其去泛素化酶活性。
　　1)抑制GSK3β或

10、過表達USP48磷酸化位點失活質(zhì)粒對TRAF2和USP48之間相互結(jié)合無影響;
　　2)抑制GSK3β削弱USP48去泛素化TRAF2;
　　3)USP48磷酸化位點失活導致其去泛素化酶活性降低;
　　4)GSK3βS9A增強USP48去泛素化酶活性。
　　6.敲降USP48削弱TRAF2介導JNK1激活，進而增加E-鈣黏蛋白表達。
　　1)敲降USP48削弱TNFα介導的JNK1和c-Jun的磷酸化;

11、r>　　2)敲降USP48增加E-鈣黏蛋白表達;
　　3)抑制JNK削弱TNFα使E-鈣黏蛋白表達下調(diào);
　　4)抑制TNIK削弱TNFα使E-鈣黏蛋白表達下調(diào);
　　5)敲降USP48削弱TNFα使E-鈣黏蛋白表達下調(diào);
　　6)敲降USP48增加E-鈣黏蛋白mRNA水平;
　　7)抑制JNK或TNIK增加E-鈣黏蛋白mRNA水平。
　　7.敲降USP48或抑制JNK或TNIK增加上皮屏障完整性。<

12、br>　　1)敲降USP48增加跨上皮細胞電阻抗值;
　　2)抑制JNK或TNIK增加跨上皮細胞電阻抗值;
　　3)敲降USP48促進LPA使跨上皮細胞電阻抗值升高。
　　結(jié)論:
　　1.GSK3β磷酸化USP48增強其去泛素酶活性，有利于使TRAF2蛋白更穩(wěn)定，促進TNFα使JNK激活;
　　2.下調(diào)USP48僅影響TNFα使JNK激活，對TNFα使NF-κB激活無影響;
　　3.抑制JNK或TNI