構(gòu)巢曲霉乙醇誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建及其應(yīng)用于煙草莖尖生長控制的初步研究.pdf

1、在過往的植物基因表達(dá)研究中，由于自然突變體的不易獲得，同時(shí)人工誘發(fā)的突變體通常不能依照所期望的結(jié)果去表達(dá)，這給繼續(xù)開展植物基因表達(dá)研究工作造成了很大的困難。現(xiàn)在的研究者通過在所要表達(dá)的目的基因上游建立一個(gè)有效的“基因開關(guān)”，構(gòu)建出可準(zhǔn)確調(diào)控的基因表達(dá)系統(tǒng)而實(shí)現(xiàn)對基因表達(dá)的人工調(diào)控，使目的基因定時(shí)、定量、定位的表達(dá)。
　　 為了分析植物發(fā)育過程中某一基因的功能，在時(shí)間和空間上控制基因表達(dá)是一種理想手段。化學(xué)誘導(dǎo)系統(tǒng)中的乙醇誘導(dǎo)基因

2、表達(dá)系統(tǒng)可以起到這種功效。在乙醇存在的情況下，基因表達(dá)激活受控于一個(gè)響應(yīng)alcR調(diào)控的alcA啟動(dòng)子。表達(dá)alcR的組織特異性啟動(dòng)子可以精確控制基因在有限空間內(nèi)的表達(dá)。從而實(shí)現(xiàn)體外施加誘導(dǎo)劑乙醇的操縱下，對轉(zhuǎn)化株體內(nèi)的目的基因的表達(dá)實(shí)現(xiàn)可控性。此外，在乙醇系統(tǒng)下，報(bào)告基因的激活和失活，遵循乙醇誘導(dǎo)的頻次，該動(dòng)力學(xué)現(xiàn)象說明乙醇誘導(dǎo)系統(tǒng)是動(dòng)態(tài)的、高度靈敏的，并且適合在時(shí)間上精確控制基因表達(dá)，研究某一種性狀的可恢復(fù)性改變。
　　 RN

3、A沉默(RNAsilencing)是真核生物體內(nèi)普遍保守的、發(fā)生在RNA水平的、基于核酸序列同源性相互作用的一種對基因表達(dá)的調(diào)控機(jī)制。通過設(shè)計(jì)反向重復(fù)序列構(gòu)建在植物體內(nèi)產(chǎn)生雙鏈RNA來誘導(dǎo)RNA沉默的方法是一條非常有效的植物基因研究途徑。將可以在植物體內(nèi)造成某一基因沉默的反向重復(fù)構(gòu)件，作為乙醇誘導(dǎo)系統(tǒng)下的操控對象，實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株體內(nèi)特定區(qū)域的可恢復(fù)性基因沉默。對乙醇誘導(dǎo)系統(tǒng)在實(shí)際研究中的進(jìn)一步發(fā)展使得該系統(tǒng)本身具有了更廣闊和完善的使用空

4、間。
　　 本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)正是在上述研究思路下，將植物莖尖分生組織中特異性啟動(dòng)子WUSP及細(xì)胞骨架蛋白基因ACTIN的RNA沉默構(gòu)件結(jié)合到乙醇誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)中，力圖在農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化成功后，實(shí)現(xiàn)對實(shí)驗(yàn)對象煙草的頂端生長控制。
　　 試驗(yàn)過程中培養(yǎng)了構(gòu)巢曲霉（Aspergillusnidulans），提取基因組，設(shè)計(jì)特異性引物，PCR擴(kuò)增獲得了乙醇誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)所需的啟動(dòng)子alcAP;另提取構(gòu)巢曲霉總RNA，RT-PCR擴(kuò)增獲得調(diào)控

5、因子alcR全序列;培養(yǎng)野生型擬南芥（Arabidopsisthaliana），提取基因組，PCR擴(kuò)增獲得莖尖干細(xì)胞調(diào)控區(qū)特異表達(dá)的啟動(dòng)子WUSP;提取煙草（NicotianatabacumL.）基因組，PCR擴(kuò)增獲得管家基因肌動(dòng)蛋白ACTIN的部分序列，作為干擾序列;獲得重組表達(dá)載體，由WUSP控制alcR的表達(dá)，由alcAP控制ACTIN干擾序列的表達(dá);重組載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404后，得到重組農(nóng)桿菌菌株P(guān)CA3301-AA，使用

6、農(nóng)桿菌侵染法轉(zhuǎn)化煙草獲得帶有該系統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因植株。
　　 同時(shí)構(gòu)建乙醇誘導(dǎo)下的GUS檢測系統(tǒng)，使用該重組表達(dá)載體對乙醇誘導(dǎo)的實(shí)效性進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)驗(yàn)證:由CaMV35S啟動(dòng)子控制alcR的表達(dá)，由alcAP控制GUS基因的表達(dá);重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404，得到重組農(nóng)桿菌菌株P(guān)CA3301-AG，該菌株侵染煙草NC89葉片，乙醇誘導(dǎo)，暗環(huán)境下共培養(yǎng)，第4天進(jìn)行GUS表達(dá)的組織化學(xué)染色。
　　 論文實(shí)驗(yàn)完成了對乙醇誘導(dǎo)表