塵螨疫苗治療對呼吸道天然免疫調(diào)節(jié)機制的研究.pdf

1、目的:研究表明支氣管哮喘削弱肺部天然免疫，增加感染和定植風(fēng)險，塵螨疫苗特異性免疫治療對哮喘有較好的療效，而塵螨疫苗對肺部天然免疫的影響目前未見報道，因此本實驗研究塵螨疫苗對哮喘宿主抗感染能力的影響，并探討其可能的起效機制。
　　方法:1.動物實驗:①4-6周齡SPF級雌性Balb/c小鼠隨機分為PBS對照組、哮喘組和塵螨疫苗治療組。哮喘組和治療組通過3次腹腔注射致敏和7次滴鼻激發(fā)建立哮喘模型，治療組激發(fā)前進(jìn)行皮下免疫治療8次干預(yù)，

2、對照組全程同步作PBS對照處理。末次激發(fā)24h后，測定小鼠氣道反應(yīng)性，肺泡灌洗液細(xì)胞分類計數(shù)，肺組織病理學(xué)檢查，ELISA法測血清中抗原特異性IgE、IgG1和IgG2a水平。②4-6周齡SPF級雌性Balb/c小鼠隨機分為PBS對照組、感染組、哮喘感染組和塵螨疫苗感染組。哮喘感染組和塵螨疫苗感染組通過3次腹腔注射致敏和7次滴鼻激發(fā)建立哮喘模型，塵螨疫苗感染組激發(fā)前進(jìn)行皮下免疫治療8次干預(yù)，感染組用PBS代替致敏、治療和激發(fā)，感染組、哮

3、喘感染組和塵螨疫苗感染組在末次激發(fā)后24h滴鼻感染綠膿桿菌，對照組全程同步作PBS對照處理。感染24h后測定小鼠肛溫，肺泡灌洗液中細(xì)胞分類計數(shù)和細(xì)菌含量觀察，肺組織病理學(xué)檢查，肺勻漿涂板測定細(xì)菌負(fù)荷量。③4-6周齡SPF級雌性Balb/c小鼠隨機分為PBS對照組、哮喘組和塵螨疫苗治療組。哮喘組和治療組通過3次腹腔注射致敏和7次滴鼻激發(fā)建立哮喘模型，治療組激發(fā)前進(jìn)行皮下免疫治療8次干預(yù)，對照組全程同步作PBS對照處理。末次激發(fā)24h后EL

4、ISA法測定小鼠肺泡灌洗液中抗菌肽CRAMP(cathelicidin related antimicrobial peptide)水平，免疫熒光法和實時熒光定量PCR法檢測肺組織中CRAMP蛋白和基因表達(dá)，ELISA法檢測肺泡灌洗液中IL-4、IFN-γ、IL-10和TGF-β1濃度，免疫組織化學(xué)法檢測CYP27b1表達(dá)。2.細(xì)胞實驗:①空白培養(yǎng)基、25(OH)2 VD3、TGF-β1+25(OH)2 VD3、IFN-γ+25(OH)

5、2 VD3、 IL-10+25(OH)2 VD3、 TGF-β1、 IFN-γ、IL-10和1,25(OH)2VD3刺激人支氣管上皮細(xì)胞后，實時熒光定量PCR法測人抗菌肽CAMP(cathelicidin antimicrobial peptide)表達(dá)。②不同濃度TGF-β1刺激人支氣管上皮細(xì)胞后，實時熒光定量PCR和免疫印跡法檢測CYP27b1蛋白和基因表達(dá)。③ITRA預(yù)處理后，經(jīng)25(OH)2 VD3、TGF-β1+25(OH)2

6、 VD3和TGF-β1刺激人支氣管上皮細(xì)胞，免疫印跡法和實時熒光定量PCR檢測人抗菌肽CAMP蛋白和基因表達(dá)。④ITRA預(yù)處理后，經(jīng)25(OH)2 VD3、TGF-β1+25(OH)2 VD3和TGF-β1刺激人支氣管上皮細(xì)胞，再綠膿桿菌感染細(xì)胞，細(xì)胞勻漿涂板測定細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌含量。結(jié)果:1.動物實驗:①塵螨疫苗治療后小鼠Penh值明顯低于哮喘組(P＜0.01)，肺泡灌洗液中各炎性細(xì)胞均減少（均P＜0.01），血清中特異性IgE和IgG1比

7、哮喘組降低（均P＜0.01），IgG2a高于哮喘組(P＜0.01)，肺組織氣道炎癥減輕。②經(jīng)塵螨疫苗治療的小鼠肛溫低于哮喘感染組(P＜0.01)，肺泡灌洗液中各炎性細(xì)胞均減少(均P＜0.01)，肺組織中和肺泡灌洗液中的細(xì)菌負(fù)荷均減少（均P＜0.01），肺組織感染病變減輕。③塵螨疫苗治療后小鼠肺泡灌洗液中CRAMP含量增加(P＜0.01)，肺組織中CRAMP的mRNA(P＜0.01)和蛋白(P＜0.01)表達(dá)均升高，肺泡灌洗液中IFN-γ

8、、 TGF-β1和IL-10表達(dá)增高（均P＜0.01），IL-4表達(dá)降低(P＜0.01)，肺組織中CYP27b1表達(dá)增加。2.細(xì)胞實驗:①TGF-β1+25(OH)2 VD3組、25(OH)2 VD3組和1，25(OH)2 VD3組細(xì)胞CAMPmRNA表達(dá)上調(diào)（均P＜0.01），且TGF-β1+25(OH)2 VD3組比25(OH)2 VD3組更高(P＜0.05)。②濃度為0.1 ng/ml、1ng/ml和10ng/ml的TGF-β1增

9、加人支氣管上皮細(xì)胞CYP27b1蛋白和mRNA的表達(dá)（均P＜0.01）。③ITRA降低TGF-β1+25(OH)2 VD3對CAMP蛋白和mRNA的上調(diào)作用(均P＜0.01)。④TGF-β1+25(OH)2 VD3(P＜0.01)和25(OH)2 VD3(P＜0.05)減少細(xì)胞內(nèi)入侵的細(xì)菌數(shù)，并且TGF-β1+25(OH)2 VD3組比25(OH)2 VD3組(P＜0.05)菌落數(shù)更少，而ITRA抑制了TGF-β1+25(OH)2 VD