改造木糖非磷酸化代謝途徑及莽草酸途徑生物合成高附加值產(chǎn)物.pdf

1、隨著石油資源的緊缺和環(huán)境的不斷惡化，利用可再生資源構(gòu)建微生物細胞工廠生產(chǎn)化學品、燃料和藥品成為了研究重點。近年來，隨著代謝工程與合成生物學的發(fā)展，實現(xiàn)了多種天然產(chǎn)物的生物合成。但是，由于缺乏已知的代謝途徑或相關(guān)酶，且很多非天然產(chǎn)物沒有相關(guān)的代謝途徑，導致許多高附加值產(chǎn)物無法實現(xiàn)生物合成。為了解決這一問題，本研究利用酶的混雜性或改造已有酶的催化性質(zhì)，從而拓寬酶的底物譜并構(gòu)建人工代謝通路，實現(xiàn)了6種高附加值化合物的生物合成。
　　木糖

2、作為木質(zhì)纖維素中的第二大糖，在微生物中的代謝效率卻遠遠低于葡萄糖。為了提高大腸桿菌的木糖利用效率，我們研究了木糖非磷酸化代謝途徑中不同來源的相關(guān)酶，優(yōu)化了木糖非磷酸化途徑在大腸桿菌中的表達。并以此為基礎(chǔ)，利用酶的混雜性，篩選途徑中的關(guān)鍵酶，成功在大腸桿菌中鑒定了新的3，4-二羥基丁醛脫氫酶，從而構(gòu)建了一條全新的3，4-二羥基丁酸生物合成途徑，通過優(yōu)化代謝網(wǎng)絡(luò)，3，4-二羥基丁酸的搖瓶產(chǎn)量達到1.27g/L，是目前已報導的最高產(chǎn)量。接著，

3、我們利用蛋白質(zhì)工程方法，理性設(shè)計并改造丙二醇脫水酶，通過解除底物抑制、增大催化口袋和優(yōu)化金屬離子催化距離將一個天然不催化1，2，4-丁三醇的酶改造為可利用1，2，4-丁三醇生產(chǎn)1，4-丁二醇的酶。在此基礎(chǔ)上，優(yōu)化了由木糖合成1，2，4-丁三醇的途徑并與改造后的丙二醇脫水酶偶聯(lián)實現(xiàn)了1，4-丁二醇從頭合成代謝新途徑的構(gòu)建，搖瓶產(chǎn)量達到209mg/L。由于目前木糖生產(chǎn)1，4-丁二醇過程中最主要的副產(chǎn)物是1，2，4-丁三醇，因此，本研究不僅成

4、功得到了一個天然不存在的新酶，同時還實現(xiàn)了副產(chǎn)物向目標產(chǎn)品的二次轉(zhuǎn)化。在上述研究基礎(chǔ)上，我們評估了木糖三種代謝途徑的碳利用率，首次發(fā)現(xiàn)了，木糖的磷酸化途徑和非磷酸化途徑在生產(chǎn)TCA循環(huán)衍生物過程中存在協(xié)同效應(yīng)。以木糖生產(chǎn)戊二酸為例，當兩條途徑協(xié)同生產(chǎn)時，戊二酸的產(chǎn)量為602mg/L，高于單獨使用任意一條途徑時的產(chǎn)量(104或209mg/L)，甚至高于單獨利用葡萄糖生產(chǎn)戊二酸的產(chǎn)量(420mg/L)。本研究不僅實現(xiàn)了利用酶的混雜性和蛋白質(zhì)

5、工程策略生產(chǎn)沒有代謝途徑的非天然產(chǎn)物，還展示了一種木糖高效利用的新策略。
　　另外，我們還利用酶的混雜性首次實現(xiàn)了三種未知天然合成途徑的重要酚類化合物（焦性沒食子酸、水楊醇和龍膽醇）的生物全合成。酚類化合物是一類芳香族化合物，具有抗菌、抗炎、抗氧化、抗癌、防紫外和防腐等生物活性，在醫(yī)藥工業(yè)上具有十分重要的價值。然而，這類化合物在自然界中的含量非常低，因此限制了它們的大規(guī)模商業(yè)化應(yīng)用。本研究首次探索并擴展了存在于斯氏假單胞菌中的苯酚

6、羥化酶PH的底物譜并揭示了該菌中的小蛋白PHQ可以增強PH的催化活性;在此基礎(chǔ)上，我們將兒茶酚的生物合成途徑與PH催化的羥基化反應(yīng)相偶聯(lián)，構(gòu)建了一條全新的焦性沒食子酸生產(chǎn)途徑，搖瓶產(chǎn)量達到76.7mg/L。接著，我們根據(jù)底物和產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)類似性，利用生物勘探法和酶的混雜性，在一系列加氧酶和羥化酶中鑒定和表征了一種十分高效的2，3-二羥基苯甲酸單加氧酶，首次實現(xiàn)了2，3-二羥基苯甲酸向焦性沒食子酸的轉(zhuǎn)化，并構(gòu)建了一條基于水楊酸單加氧酶的焦性

7、沒食子酸的生物合成新途徑。通過增加莽草酸途徑碳代謝流、模塊優(yōu)化合成途徑和緩解產(chǎn)物的自氧化等策略進行優(yōu)化，焦性沒食子酸的搖瓶產(chǎn)量達到1.04g/L。為了解決酚醇類物質(zhì)的生物合成問題，我們通過研究水楊酸-5-羥基化酶和羧酸還原酶CAR的混雜性和底物譜，首次實現(xiàn)了由水楊酸合成龍膽酸并由水楊酸和龍膽酸分別合成水楊醇和龍膽醇。再在此基礎(chǔ)上構(gòu)建并優(yōu)化了水楊醇和龍膽醇的從頭合成途徑，最終水楊醇和龍膽醇的搖瓶產(chǎn)量分別達到594.4mg/L和30.1mg