左旋聚乳酸納米纖維對PC12細胞分化影響的代謝組學(xué)研究和系統(tǒng)生物學(xué)分析.pdf

1、納米纖維能夠有效模仿細胞外基質(zhì)，提供適合的接觸引導(dǎo)來幫助神經(jīng)細胞分化和神經(jīng)突觸生長，因此成為神經(jīng)組織工程常用的生物材料。為在神經(jīng)組織工程中進一步應(yīng)用定向納米纖維，設(shè)計新的納米纖維材料表面，全面深入地闡釋定向納米纖維影響神經(jīng)細胞分化的分子機理，需要了解這個過程中所有基因、mRNA、蛋白質(zhì)、代謝物的差異表達以及組分相互間的關(guān)系。近年出現(xiàn)的高通量技術(shù)和系統(tǒng)生物學(xué)方法為從RNA、蛋白質(zhì)、代謝物等層次，全而系統(tǒng)地了解生物材料對細胞的影響和深入研究

2、分子機理提供了強有力的技術(shù)方法支持。
　　本論文的目的是綜合運用代謝組學(xué)技術(shù)和生物信息學(xué)方法，研究左旋聚乳酸定向/不定向納米纖維對PC12細胞內(nèi)代謝物表達的影響，在代謝層次揭示旋聚乳酸定向/不定向納米纖維對PC12細胞的影響。隨后與本課題組前期的研究結(jié)果（轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)）進行聯(lián)合分析，從系統(tǒng)生物學(xué)的角度闡釋PLLA定向納米纖維影響PC12細胞分化的機理。
　　本論文的具體工作如下:
　　1、采用靜電紡絲法制備左旋

3、聚乳酸(PLLA)定向/不定向納米纖維，采用勻膠法制備PLLA薄膜。對三種材料進行了掃描電子顯微鏡(SEM)觀察。結(jié)果表明，PLLA薄膜表面比較平滑，PLLA定向/不定向納米纖維粗細均一且無串珠，纖維直徑分別為279.58±6.67 nm和245.02±7.93nm，定向納米纖維具有較好的取向性;
　　2、將預(yù)分化48h的PC12細胞分別種植在PLLA定向納米纖維（實驗組1，簡稱AF組）、PLLA不定向納米纖維（實驗組2，簡稱RF

4、組）和PLLA薄膜（對照組，簡稱C組）上12h、24h和36h，搜集細胞樣本用于代謝組學(xué)實驗，一共六個實驗組(AF組的三個間分別簡稱為A12、A24和A36，RF組的分別簡稱為R12、R24和R36)，三個對照組（分別簡稱為C12、C24和C36），每組106～107個細胞樣本(n=5);
　　3、采用基于液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用的代謝組學(xué)研究手段，分別分析了PC12細胞種植在左旋聚乳酸的三種表面（定向納米纖維表面、不定向納米纖維表面和薄

5、膜表面）12h、24h和36h后，細胞內(nèi)代謝物的表達進行相對定性分析，得到六個實驗組和三個對照組的代謝物表達譜峰圖。使用主成分分析法和最小二乘判別分析法結(jié)合t檢驗，篩選得到相對于對照組差異表達的代謝物，相對于C12組，A12組和R12組差異表達的代謝物數(shù)目分別為53種和54種，相對于C24組，A24組和R24組差異表達的代謝物數(shù)目分別為50種和47種，相對于C36組，A36組和R36組差異表達的代謝物數(shù)目分別為32種和42種;
　

6、　4、采用生物信息學(xué)方法對差異表達代謝物進行了聚類分析和MetPA分析，發(fā)現(xiàn)在PLLA定向和不定向納米纖維這兩種表面上培養(yǎng)了12h的細胞內(nèi)代謝物表達情況與培養(yǎng)了24h和36h的細胞內(nèi)代謝物表達情況差別較大，對AF組和RF組三個時間點均差異表達的代謝物進行通路分析，得到的通路中，AF組與RF組共有的通路苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成，苯丙氨酸代謝，組氨酸代謝以及AF組有而RF組沒有的花生四烯酸代謝和?；撬幔瑏喤；撬岽x通路與神經(jīng)細胞的分

7、化相關(guān);
　　5、對所得的代謝組學(xué)實驗數(shù)據(jù)和課題組前期得到的轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)實驗數(shù)據(jù)進行聯(lián)合分析，得到種植在PLLA定向納米纖維表面的PC12細胞內(nèi)基因、蛋白質(zhì)和代謝物的差異表達引起的通路有11條，而PLLA不定向納米纖維表面的PC12細胞內(nèi)基因、蛋白質(zhì)和代謝物的差異表達引起的通路有7條。在這些通路中，AF組與RF組共有的通路酪氨酸通路和AF組有而RF組沒有的鞘脂類代謝和甘油磷脂代謝通路與分化相關(guān)，從氨基酸代謝和脂質(zhì)代謝兩個部

8、分對PLLA影響PC12細胞的分化機理進行討論發(fā)現(xiàn)，基因Lao1的下調(diào)表達導(dǎo)致了苯丙氨酸的下調(diào)表達，加之與酪氨酸分解相關(guān)的蛋白質(zhì)Gstz1上調(diào)表達，導(dǎo)致酪氨酸下調(diào)表達?；駻oc3上調(diào)表達與基因Aldh3a1下調(diào)表達的共同作用下，多巴胺上調(diào)表達?；駻ldh3a1的下調(diào)表達導(dǎo)致去甲變腎上腺素的上調(diào)表達。基因Pla2g4b上調(diào)表達導(dǎo)致磷脂酶的上調(diào)表達，促進了溶血磷脂和花生四烯酸的釋放，因此能夠分泌更多神經(jīng)遞質(zhì)。因此PLLA定向納米纖維表面