PLLA定向納米纖維對PC12細胞分化影響的mRNA與microRNA水平研究.pdf

1、引導神經(jīng)細胞正確的分化和成熟，使得神經(jīng)細胞最終能行使其正常的功能，是神經(jīng)組織工程和神經(jīng)干細胞治療中一個至關重要的目標和方向。目前研究了多種納微米尺度下具有特定形貌（如微槽、納米坑、納米纖維等）的生物材料對神經(jīng)細胞的影響。其中，電紡定向納米纖維因能模仿細胞外基質(zhì)和提供適合的接觸引導來幫助神經(jīng)細胞分化及神經(jīng)突觸生長，受到許多研究者的青睞。對于定向納米纖維影響神經(jīng)細胞分化的分子機理研究，目前主要是采用傳統(tǒng)的分子生物學技術來研究，發(fā)現(xiàn)了單個或少

2、量發(fā)揮重要作用的基因和蛋白質(zhì)。然而在神經(jīng)組織工程中進一步應用定向納米纖維和設計對神經(jīng)細胞有可控能力的納米纖維材料表面，需要全面深入地闡釋定向納米纖維影響神經(jīng)細胞分化的分子機理，而這離不開整體性大范圍內(nèi)了解基因或蛋白質(zhì)的變化，傳統(tǒng)的分子生物學技術顯然不能滿足這一需要。近年來出現(xiàn)的高通量技術（基因表達譜芯片、測序等）和系統(tǒng)生物學方法為從RNA、蛋白質(zhì)、代謝物等層次，全面系統(tǒng)地了解生物材料對細胞的影響和深入研究分子機理提供了強有力的技術方法支

3、持。本論文的研究內(nèi)容是課題組申請的國家自然科學基金項目“定向納米纖維誘導神經(jīng)細胞生長機理的系統(tǒng)生物學研究”的一部分，旨在通過綜合運用基因表達譜芯片技術、SOLiD測序技術、生物信息學方法和分子生物學技術，從RNA水平（這里主要是mRNA和microRNA）系統(tǒng)分析電紡左旋聚乳酸(PLLA)不定向/定向納米纖維對PC12細胞分化及mRNA、microRNA表達譜的影響，揭示并驗證PLLA定向納米纖維影響PC12細胞分化的分子機制，從而拓寬

4、人們對定向納米纖維影響神經(jīng)細胞分化分子機理的認識，為最終從系統(tǒng)生物學角度闡釋定向納米纖維影響神經(jīng)細胞分化的分子機制以及在神經(jīng)組織工程等領域中設計和應用納米纖維打下基礎。
　　本論文的具體工作如下:
　　1、采用靜電紡絲技術成功制備出PLLA不定向/定向納米纖維。由化學組成相同的PLLA溶液均勻涂覆在聚苯乙烯基底上制得PLLA薄膜。使用掃描電鏡、紅外光譜儀等對制得的三種PLLA基底（PLLA不定向納米纖維、PLLA定向納米纖維

5、和PLLA薄膜）進行表征，發(fā)現(xiàn)制備的PLLA不定向/定向納米纖維粗細均勻且無串珠，PLLA薄膜基本光滑平整。PLLA定向納米纖維具有明顯的取向性。PLLA不定向/定向納米纖維的直徑分別為238.68±5.77nm和217.83±7.00nm。三種PLLA基底的化學組成相同，均為左旋聚乳酸。力學性能檢測發(fā)現(xiàn)，納米纖維的取向性對其拉伸強度有很大的影響，PLLA定向納米纖維的彈性模量（860.95±76.58MPa）顯著大于PLLA不定向納米

6、纖維(131.71±13.71MPa)。
　　2、將分化中的PC12細胞分別種植在PLLA薄膜（對照組）、PLLA不定向納米纖維(RF組)和PLLA定向納米纖維(AF組)上，并從細胞活力、葡萄糖乳酸代謝、細胞形態(tài)、神經(jīng)突觸長度等角度評價了PLLA納米纖維對PC12細胞的影響。結(jié)果顯示，PLLA不定向/定向納米纖維能提高PC12細胞的活力和葡萄糖乳酸的代謝水平，同時PLLA不定向/定向納米纖維能影響PC12細胞神經(jīng)突觸的伸展，尤其是

7、PLLA定向納米纖維能顯著促進PC12細胞神經(jīng)突觸的生長，這提示PLLA定向納米纖維可能有助于PC12細胞的分化。
　　3、進一步采用qRT-PCR技術檢測PC12細胞內(nèi)GAP43基因（一種神經(jīng)細胞分化的標志基因）的表達，結(jié)果表明AF組中GAP43基因的表達水平顯著高于對照組和RF組。這一結(jié)果說明，與PLLA薄膜和PLLA不定向納米纖維相比，PLLA定向納米纖維更利于PC12細胞的分化?；虮磉_譜芯片實驗分析PC12細胞內(nèi)的mRN

8、A表達譜，發(fā)現(xiàn)與對照組相比，RF組和AF組中分別有876和1937個基因發(fā)生差異表達。對RF組和AF組中的差異表達基因進行GO功能分析，發(fā)現(xiàn)分別有493和1193個差異基因與神經(jīng)細胞分化相關，可見PLLA定向納米纖維比PLLA不定向納米纖維觸發(fā)更多神經(jīng)細胞分化相關的基因發(fā)生差異表達。通路分析和qRT-PCR、Western blot等驗證實驗進一步確認PLLA定向納米纖維能激發(fā)整聯(lián)蛋白介導的FAK-MEK-ERK通路相關基因和蛋白（Tl

9、n1，Map2k5和磷酸化ERK1/2等）的表達;而采用GRGDS五肽競爭性干擾PLLA定向納米纖維上PC12細胞的整聯(lián)蛋白，能顯著阻礙PC12細胞分化和降低整聯(lián)蛋白介導的FAK-MEK-ERK通路相關基因和蛋白的表達。此外本論文還采用RNA干擾技術發(fā)現(xiàn)Pafah1b1基因的上調(diào)表達也有利于PC12細胞的分化。這些結(jié)果表明PLLA定向納米纖維可能通過表面吸附的蛋白質(zhì)與PC12細胞整聯(lián)蛋白發(fā)生作用，觸發(fā)整聯(lián)蛋白介導的FAK-MEK-ERK

10、信號通路激活及Pafah1b1等基因上調(diào)表達，從而促進PC12細胞的分化。
　　4、采用SOLiD測序技術全面分析了PLLA不定向/定向納米纖維對PC12細胞內(nèi)microRNA表達譜的影響，并用qRT-PCR技術對測序結(jié)果進行驗證。隨后使用生物信息學方法對差異表達microRNA的靶基因進行了預測，并分析靶基因的生物學功能。結(jié)果顯示，RF組和AF組中分別有42個和94個microRNA發(fā)生差異表達，AF組中的差異表達microRN

11、A調(diào)控的相應靶基因和信號通路也更多。RF和AF組中的差異表達microRNA均能影響整聯(lián)蛋白介導的細胞粘附通路、粘著斑信號通路中相關基因的表達，這提示PLLA不定向/定向納米纖維可能引發(fā)microRNA對整聯(lián)蛋白相關信號通路進行綜合調(diào)控，從而對PC12細胞的分化產(chǎn)生作用。
　　5、通過聯(lián)合分析PC12細胞內(nèi)的microRNA和mRNA表達譜，以實驗實際檢測到的差異表達基因驗證差異表達microRNA的靶基因，本論文全面系統(tǒng)地研究了

12、PLLA不定向/定向納米纖維影響PC12細胞分化過程中關鍵的microRNA及其調(diào)控的靶基因和生物學功能。結(jié)果顯示，PLLA不定向納米纖維沒有發(fā)現(xiàn)能引起與神經(jīng)細胞分化密切相關的microRNA發(fā)生差異表達，而PLLA定向納米纖維可能通過miR-18a、miR-23b、miR-103、miR-107、miR-92a、miR-339-5p、miR-25等調(diào)控Rras2、 Nf1、Pafah1b1基因，進而調(diào)控細胞骨架信號通路、MAPK信號通

13、路，對PC12細胞的遷移、分化產(chǎn)生作用。此外，本論文還發(fā)現(xiàn)miR-185、miR-186、miR-148b-3p等microRNA在PLLA定向納米纖維影響PC12細胞的軸突導向、遷移等功能中可能發(fā)揮重要的調(diào)控作用。
　　6、本論文在發(fā)現(xiàn)GRGDS五肽競爭性干擾PC12細胞的整聯(lián)蛋白，能顯著阻礙PLLA定向納米纖維對PC12細胞分化的促進作用和降低整聯(lián)蛋白介導的FAK-MEK-ERK通路相關基因和蛋白的表達后，進一步通過采用基因表

14、達譜芯片技術和SOLiD測序技術，全面系統(tǒng)的分析了種植在PLLA定向納米纖維上的PC12細胞在受到GRGDS五肽干擾后（GA組），胞內(nèi)mRNA和microRNA的變化。結(jié)果顯示，與未受到GRGDS五肽干擾的正常PLLA定向納米纖維組（AF組）相比，GA組中有1594個基因顯著上調(diào)表達，1436個基因顯著下調(diào)表達;GA組中共有23個microRNA顯著下調(diào)，共有73個microRNA顯著上調(diào)。聯(lián)合分析mRNA表達譜與microRNA表達譜

15、并綜合前面的實驗結(jié)果，本論文發(fā)現(xiàn)整聯(lián)蛋白受到GRGDS五肽競爭性干擾后，PLLA定向納米纖維上的PC12細胞分化受到抑制，同時觸發(fā)胞內(nèi)14個microRNA（miR-27a、miR-27b、miR-342-5p、miR-23a等）調(diào)控10個基因（Ndfufs4、Ppp1r3b、E2f1、Rras2等），影響PC12細胞的氨基酸代謝、生物合成、細胞骨架、細胞周期等多個方面的功能，可見整聯(lián)蛋白在PLLA定向納米纖維促進PC12細胞分化過程中