PLLA定向納米纖維對(duì)PC12細(xì)胞分化影響的mRNA與microRNA水平研究.pdf

1、引導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞正確的分化和成熟，使得神經(jīng)細(xì)胞最終能行使其正常的功能，是神經(jīng)組織工程和神經(jīng)干細(xì)胞治療中一個(gè)至關(guān)重要的目標(biāo)和方向。目前研究了多種納微米尺度下具有特定形貌（如微槽、納米坑、納米纖維等）的生物材料對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的影響。其中，電紡定向納米纖維因能模仿細(xì)胞外基質(zhì)和提供適合的接觸引導(dǎo)來(lái)幫助神經(jīng)細(xì)胞分化及神經(jīng)突觸生長(zhǎng)，受到許多研究者的青睞。對(duì)于定向納米纖維影響神經(jīng)細(xì)胞分化的分子機(jī)理研究，目前主要是采用傳統(tǒng)的分子生物學(xué)技術(shù)來(lái)研究，發(fā)現(xiàn)了單個(gè)或少

2、量發(fā)揮重要作用的基因和蛋白質(zhì)。然而在神經(jīng)組織工程中進(jìn)一步應(yīng)用定向納米纖維和設(shè)計(jì)對(duì)神經(jīng)細(xì)胞有可控能力的納米纖維材料表面，需要全面深入地闡釋定向納米纖維影響神經(jīng)細(xì)胞分化的分子機(jī)理，而這離不開(kāi)整體性大范圍內(nèi)了解基因或蛋白質(zhì)的變化，傳統(tǒng)的分子生物學(xué)技術(shù)顯然不能滿足這一需要。近年來(lái)出現(xiàn)的高通量技術(shù)（基因表達(dá)譜芯片、測(cè)序等）和系統(tǒng)生物學(xué)方法為從RNA、蛋白質(zhì)、代謝物等層次，全面系統(tǒng)地了解生物材料對(duì)細(xì)胞的影響和深入研究分子機(jī)理提供了強(qiáng)有力的技術(shù)方法支

3、持。本論文的研究?jī)?nèi)容是課題組申請(qǐng)的國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目“定向納米纖維誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)機(jī)理的系統(tǒng)生物學(xué)研究”的一部分，旨在通過(guò)綜合運(yùn)用基因表達(dá)譜芯片技術(shù)、SOLiD測(cè)序技術(shù)、生物信息學(xué)方法和分子生物學(xué)技術(shù)，從RNA水平（這里主要是mRNA和microRNA）系統(tǒng)分析電紡左旋聚乳酸(PLLA)不定向/定向納米纖維對(duì)PC12細(xì)胞分化及mRNA、microRNA表達(dá)譜的影響，揭示并驗(yàn)證PLLA定向納米纖維影響PC12細(xì)胞分化的分子機(jī)制，從而拓寬

4、人們對(duì)定向納米纖維影響神經(jīng)細(xì)胞分化分子機(jī)理的認(rèn)識(shí)，為最終從系統(tǒng)生物學(xué)角度闡釋定向納米纖維影響神經(jīng)細(xì)胞分化的分子機(jī)制以及在神經(jīng)組織工程等領(lǐng)域中設(shè)計(jì)和應(yīng)用納米纖維打下基礎(chǔ)。
　　本論文的具體工作如下:
　　1、采用靜電紡絲技術(shù)成功制備出PLLA不定向/定向納米纖維。由化學(xué)組成相同的PLLA溶液均勻涂覆在聚苯乙烯基底上制得PLLA薄膜。使用掃描電鏡、紅外光譜儀等對(duì)制得的三種PLLA基底（PLLA不定向納米纖維、PLLA定向納米纖維

5、和PLLA薄膜）進(jìn)行表征，發(fā)現(xiàn)制備的PLLA不定向/定向納米纖維粗細(xì)均勻且無(wú)串珠，PLLA薄膜基本光滑平整。PLLA定向納米纖維具有明顯的取向性。PLLA不定向/定向納米纖維的直徑分別為238.68±5.77nm和217.83±7.00nm。三種PLLA基底的化學(xué)組成相同，均為左旋聚乳酸。力學(xué)性能檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，納米纖維的取向性對(duì)其拉伸強(qiáng)度有很大的影響，PLLA定向納米纖維的彈性模量（860.95±76.58MPa）顯著大于PLLA不定向納米

6、纖維(131.71±13.71MPa)。
　　2、將分化中的PC12細(xì)胞分別種植在PLLA薄膜（對(duì)照組）、PLLA不定向納米纖維(RF組)和PLLA定向納米纖維(AF組)上，并從細(xì)胞活力、葡萄糖乳酸代謝、細(xì)胞形態(tài)、神經(jīng)突觸長(zhǎng)度等角度評(píng)價(jià)了PLLA納米纖維對(duì)PC12細(xì)胞的影響。結(jié)果顯示，PLLA不定向/定向納米纖維能提高PC12細(xì)胞的活力和葡萄糖乳酸的代謝水平，同時(shí)PLLA不定向/定向納米纖維能影響PC12細(xì)胞神經(jīng)突觸的伸展，尤其是

7、PLLA定向納米纖維能顯著促進(jìn)PC12細(xì)胞神經(jīng)突觸的生長(zhǎng)，這提示PLLA定向納米纖維可能有助于PC12細(xì)胞的分化。
　　3、進(jìn)一步采用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)PC12細(xì)胞內(nèi)GAP43基因（一種神經(jīng)細(xì)胞分化的標(biāo)志基因）的表達(dá)，結(jié)果表明AF組中GAP43基因的表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組和RF組。這一結(jié)果說(shuō)明，與PLLA薄膜和PLLA不定向納米纖維相比，PLLA定向納米纖維更利于PC12細(xì)胞的分化。基因表達(dá)譜芯片實(shí)驗(yàn)分析PC12細(xì)胞內(nèi)的mRN

8、A表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，RF組和AF組中分別有876和1937個(gè)基因發(fā)生差異表達(dá)。對(duì)RF組和AF組中的差異表達(dá)基因進(jìn)行GO功能分析，發(fā)現(xiàn)分別有493和1193個(gè)差異基因與神經(jīng)細(xì)胞分化相關(guān)，可見(jiàn)PLLA定向納米纖維比PLLA不定向納米纖維觸發(fā)更多神經(jīng)細(xì)胞分化相關(guān)的基因發(fā)生差異表達(dá)。通路分析和qRT-PCR、Western blot等驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步確認(rèn)PLLA定向納米纖維能激發(fā)整聯(lián)蛋白介導(dǎo)的FAK-MEK-ERK通路相關(guān)基因和蛋白（Tl

9、n1，Map2k5和磷酸化ERK1/2等）的表達(dá);而采用GRGDS五肽競(jìng)爭(zhēng)性干擾PLLA定向納米纖維上PC12細(xì)胞的整聯(lián)蛋白，能顯著阻礙PC12細(xì)胞分化和降低整聯(lián)蛋白介導(dǎo)的FAK-MEK-ERK通路相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)。此外本論文還采用RNA干擾技術(shù)發(fā)現(xiàn)Pafah1b1基因的上調(diào)表達(dá)也有利于PC12細(xì)胞的分化。這些結(jié)果表明PLLA定向納米纖維可能通過(guò)表面吸附的蛋白質(zhì)與PC12細(xì)胞整聯(lián)蛋白發(fā)生作用，觸發(fā)整聯(lián)蛋白介導(dǎo)的FAK-MEK-ERK

10、信號(hào)通路激活及Pafah1b1等基因上調(diào)表達(dá)，從而促進(jìn)PC12細(xì)胞的分化。
　　4、采用SOLiD測(cè)序技術(shù)全面分析了PLLA不定向/定向納米纖維對(duì)PC12細(xì)胞內(nèi)microRNA表達(dá)譜的影響，并用qRT-PCR技術(shù)對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。隨后使用生物信息學(xué)方法對(duì)差異表達(dá)microRNA的靶基因進(jìn)行了預(yù)測(cè)，并分析靶基因的生物學(xué)功能。結(jié)果顯示，RF組和AF組中分別有42個(gè)和94個(gè)microRNA發(fā)生差異表達(dá)，AF組中的差異表達(dá)microRN

11、A調(diào)控的相應(yīng)靶基因和信號(hào)通路也更多。RF和AF組中的差異表達(dá)microRNA均能影響整聯(lián)蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞粘附通路、粘著斑信號(hào)通路中相關(guān)基因的表達(dá)，這提示PLLA不定向/定向納米纖維可能引發(fā)microRNA對(duì)整聯(lián)蛋白相關(guān)信號(hào)通路進(jìn)行綜合調(diào)控，從而對(duì)PC12細(xì)胞的分化產(chǎn)生作用。
　　5、通過(guò)聯(lián)合分析PC12細(xì)胞內(nèi)的microRNA和mRNA表達(dá)譜，以實(shí)驗(yàn)實(shí)際檢測(cè)到的差異表達(dá)基因驗(yàn)證差異表達(dá)microRNA的靶基因，本論文全面系統(tǒng)地研究了

12、PLLA不定向/定向納米纖維影響PC12細(xì)胞分化過(guò)程中關(guān)鍵的microRNA及其調(diào)控的靶基因和生物學(xué)功能。結(jié)果顯示，PLLA不定向納米纖維沒(méi)有發(fā)現(xiàn)能引起與神經(jīng)細(xì)胞分化密切相關(guān)的microRNA發(fā)生差異表達(dá)，而PLLA定向納米纖維可能通過(guò)miR-18a、miR-23b、miR-103、miR-107、miR-92a、miR-339-5p、miR-25等調(diào)控Rras2、 Nf1、Pafah1b1基因，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞骨架信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通

13、路，對(duì)PC12細(xì)胞的遷移、分化產(chǎn)生作用。此外，本論文還發(fā)現(xiàn)miR-185、miR-186、miR-148b-3p等microRNA在PLLA定向納米纖維影響PC12細(xì)胞的軸突導(dǎo)向、遷移等功能中可能發(fā)揮重要的調(diào)控作用。
　　6、本論文在發(fā)現(xiàn)GRGDS五肽競(jìng)爭(zhēng)性干擾PC12細(xì)胞的整聯(lián)蛋白，能顯著阻礙PLLA定向納米纖維對(duì)PC12細(xì)胞分化的促進(jìn)作用和降低整聯(lián)蛋白介導(dǎo)的FAK-MEK-ERK通路相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)后，進(jìn)一步通過(guò)采用基因表

14、達(dá)譜芯片技術(shù)和SOLiD測(cè)序技術(shù)，全面系統(tǒng)的分析了種植在PLLA定向納米纖維上的PC12細(xì)胞在受到GRGDS五肽干擾后（GA組），胞內(nèi)mRNA和microRNA的變化。結(jié)果顯示，與未受到GRGDS五肽干擾的正常PLLA定向納米纖維組（AF組）相比，GA組中有1594個(gè)基因顯著上調(diào)表達(dá)，1436個(gè)基因顯著下調(diào)表達(dá);GA組中共有23個(gè)microRNA顯著下調(diào)，共有73個(gè)microRNA顯著上調(diào)。聯(lián)合分析mRNA表達(dá)譜與microRNA表達(dá)譜

15、并綜合前面的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本論文發(fā)現(xiàn)整聯(lián)蛋白受到GRGDS五肽競(jìng)爭(zhēng)性干擾后，PLLA定向納米纖維上的PC12細(xì)胞分化受到抑制，同時(shí)觸發(fā)胞內(nèi)14個(gè)microRNA（miR-27a、miR-27b、miR-342-5p、miR-23a等）調(diào)控10個(gè)基因（Ndfufs4、Ppp1r3b、E2f1、Rras2等），影響PC12細(xì)胞的氨基酸代謝、生物合成、細(xì)胞骨架、細(xì)胞周期等多個(gè)方面的功能，可見(jiàn)整聯(lián)蛋白在PLLA定向納米纖維促進(jìn)PC12細(xì)胞分化過(guò)程中