利用濾除白細(xì)胞分離培養(yǎng)NK細(xì)胞方法的優(yōu)化.pdf

1、目的：
　　利用制備血制品過程的濾除掉的淋巴細(xì)胞經(jīng)體外誘導(dǎo)擴(kuò)增NK細(xì)胞，對(duì)NK細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法進(jìn)行優(yōu)化，并對(duì)培養(yǎng)以后所獲得的NK細(xì)胞的功能和活性進(jìn)行檢測(cè)，為非自體NK細(xì)胞的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)室研究數(shù)據(jù)。
　　方法：
　　收集山西省血液中心2014年3月至2014年11月期間15例健康獻(xiàn)血者的新鮮外周血，將制備血液制品后廢棄的濾除白細(xì)胞回收，經(jīng)過密度梯度離心法獲得外周血中單個(gè)核細(xì)胞（peripheral blood mo

2、nonuclear cells，PBMCs），每份樣本分為3組，A組：培養(yǎng)瓶預(yù)先包被CD3mAb；B組：培養(yǎng)瓶預(yù)先包被CD16mAb；C組：培養(yǎng)瓶預(yù)先包被CD16mAb和CD3mAb，相同培養(yǎng)條件下，加入相同無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)液和細(xì)胞因子IL-2和IFN-γ誘導(dǎo)擴(kuò)增。擴(kuò)增第0、8、12、17天高倍鏡下看細(xì)胞長(zhǎng)勢(shì)并計(jì)算細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)，用流動(dòng)檢測(cè)細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表型為CD3-CD56+的細(xì)胞比例的變化，選擇NK占比最高的B組細(xì)胞成為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，分別

3、測(cè)定培養(yǎng)第0天和第17天B組NK細(xì)胞表面高活性受體（NKp30、NKp46、NKG2D）的表達(dá)及細(xì)胞殺傷因子IFN-γ的分泌水平，培養(yǎng)第17天采用LDH釋放法及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)B組NK細(xì)胞對(duì)惡性細(xì)胞K562和Raji細(xì)胞的細(xì)胞毒作用。
　　結(jié)果：
　　比較誘導(dǎo)培養(yǎng)第17天與培養(yǎng)第0天的CD3-CD56+細(xì)胞占比的變化情況，A組為[（15.19±12.22）％vs（16.34±10.51）%， p＞0.05]，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，

4、 B組為[（83.63±10.63）%vs（16.34±10.51）%， p＜0.05]， C組為[（49.40±12.64）%vs（16.34±10.51）%，p＜0.05]，B和C組培養(yǎng)第17天的CD3-CD56+細(xì)胞比例均較第0天顯著增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；第17天CD3-CD56+細(xì)胞比例B組比例顯著高于A和C組；三組NK細(xì)胞總數(shù)均大于109個(gè)；檢測(cè)B組培養(yǎng)第17天NK表面活化性受體NKp30和NKp46的表達(dá)比例均比第0天顯

5、著增高，NKG2D比例變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；B組擴(kuò)增的NK細(xì)胞對(duì)K562細(xì)胞和Raji細(xì)胞均具有殺傷能力，對(duì)K562細(xì)胞具有較高的殺傷能力。
　　結(jié)論：
　　制備血液制品后濾除掉的白細(xì)胞，安全可靠，無(wú)病原體污染，經(jīng)體外分離培養(yǎng)后，可得到比例高達(dá)90%的NK細(xì)胞，其總數(shù)大于109個(gè)，細(xì)胞殺傷能力增強(qiáng)，對(duì)惡性腫瘤細(xì)胞具有較高殺傷能力，達(dá)到臨床治療惡性疾病的應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)，濾除白細(xì)胞有希望成為臨床非自體NK細(xì)胞防治惡性腫瘤的一種細(xì)胞來源；N