新型抗腫瘤制劑-基因重組Kringle5蛋白的藥效學(xué)與毒理學(xué)研究.pdf

1、人Pgn是分子量為92kD的糖蛋白,由一個絲氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域和5個通過二硫鍵連接的餅環(huán)區(qū)(Kringle)構(gòu)成,每個餅環(huán)區(qū)由80個氨基酸組成,分子量約為14kD,含3個二硫鍵,形成雙環(huán)狀構(gòu)象。Kringle5是Pgn的第五個餅環(huán)區(qū)結(jié)構(gòu),研究證實Kringle5在體外具有抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖、抑制內(nèi)皮細(xì)胞遷移的生物學(xué)活性,在體內(nèi)可抑制多種血管新生模型的新生血管形成(angiogenesis),進(jìn)而可抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移,在實體瘤、糖尿病視網(wǎng)膜

2、病變、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等疾病的治療中有廣泛的應(yīng)用前景。
　　 Kringle5含有由3個二硫鍵形成的Kringle結(jié)構(gòu)和Kringle結(jié)構(gòu)外側(cè)的2個臂,本研究構(gòu)建的Kringle5蛋白去除了這2個臂而保留了3個二硫鍵的完整結(jié)構(gòu)。本研究在我室前期對Kringle5實驗室規(guī)模研究(見第一章)的基礎(chǔ)上,對Kringle5的生產(chǎn)制備工藝(見第二章和第三章)進(jìn)行了研究,建立了Kringle5的制備工藝；本研究進(jìn)一步對Kringle5的生物學(xué)活

3、性進(jìn)行了深入研究,包括對Kringle5體外抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的效果和機(jī)制(見第四章第一節(jié))進(jìn)行了研究、對Kringle5體外抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移和血管形成的效果(見第四章第二節(jié))進(jìn)行了研究、對Kringle5抑制小鼠移植瘤的效果和機(jī)制(見第四章第三節(jié))進(jìn)行了研究,這些工作為Kringle5蛋白的生物制劑的開發(fā)奠定了重要基礎(chǔ)；同時,本研究還采用急性經(jīng)口毒性試驗(見第五章第一節(jié))、遺傳毒性試驗(見第五章第二節(jié))和大鼠30d喂養(yǎng)試驗(見第

4、五章第三節(jié))對Kringle5的毒理學(xué)進(jìn)行了系統(tǒng)研究。本研究是新型抗腫瘤制劑-Kringle5蛋白的新藥申報材料的核心組成部分,為Kringle5蛋白的新藥開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。
　　 1基因重組Kringle5蛋白的原核表達(dá)體系的建立
　　 本研究以纖溶酶原cDNA為模板,PCR擴(kuò)增了Kringle5基因,經(jīng)過適當(dāng)酶切后構(gòu)建表達(dá)載體pBV220/Kringle5,轉(zhuǎn)入大腸桿菌JM109進(jìn)行溫控誘導(dǎo)表達(dá),表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)純化、復(fù)性后

5、檢測其抑制雞胚絨毛尿囊膜(CAM)血管新生的生物學(xué)活性。實驗結(jié)果證實帶有重組質(zhì)粒pBV220/Kringle5的大腸桿菌經(jīng)溫控誘導(dǎo)后可表達(dá)目的蛋白,其表達(dá)量占菌體總蛋白總量的34.8％,免疫學(xué)鑒定結(jié)果表明該異源重組蛋白具有His-tag抗原活性,CAM實驗證實具有抑制血管新生的野生活性。
　　 JM109/pBV220/Kringle5表達(dá)系統(tǒng)屬于PRPL串聯(lián)雙啟動子的高效原核基因表達(dá)系統(tǒng),該系統(tǒng)可在4-5h內(nèi)表達(dá)Kringle

6、5蛋白占菌體總蛋白的34.8％,表達(dá)的量較高,經(jīng)純化、復(fù)性后獲得的Kringle5蛋白具有抑制血管新生的生物學(xué)活性。
　　 本研究構(gòu)建的JM109/pBV220/Kringle5表達(dá)體系具有以下特點:①表達(dá)量高:在以上的研究中我們發(fā)現(xiàn),該表達(dá)體系表達(dá)的蛋白占菌體總蛋白的34.8％,符合發(fā)酵生產(chǎn)需要；②該技術(shù)體系表達(dá)的Kringle5蛋白,其羧基端有6個組氨酸鏈,簡化了該蛋白的分離、純化的基因工程下游工藝,也使該技術(shù)體系對于獲取該

7、蛋白提供了簡要的技術(shù)體系。③為該蛋白的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展奠定了實驗基礎(chǔ):本原核表達(dá)體系一方面保證了蛋白表達(dá)的量較高,使原料能合理利用,降低了生產(chǎn)成本；同時,使該蛋白的分離純化體系簡化,客觀上為其產(chǎn)業(yè)化發(fā)展準(zhǔn)備了條件。本研究為進(jìn)一步將Kringle5蛋白開發(fā)成新型抗腫瘤藥物奠定了實驗技術(shù)基礎(chǔ)。
　　 2基因重組Kringle5蛋白的發(fā)酵制備工藝研究
　　 本研究在本實驗室成功構(gòu)建了Kringle5的原核表達(dá)體系并證明獲得的基因重組

8、Kringle5蛋白具有抑制CAM血管生長活性的基礎(chǔ)上,應(yīng)用高密度發(fā)酵法建立并優(yōu)化了Kringle5蛋白的發(fā)酵技術(shù),采用比濁法檢測菌體密度、稱重法監(jiān)測菌體重量、SDS-PAGE凝膠電泳檢測Kringle5表達(dá)量。研究結(jié)果顯示,Kringle5基因重組蛋白基因工程菌高密度發(fā)酵的優(yōu)化條件為:取-70℃20％甘油保藏的BP-5菌種,立即置于水浴中溶解,在超凈工作臺內(nèi)取滅菌接種環(huán)涂劃含50μg/mL氨芐青霉素的LB瓊脂平板,置30℃溫箱過夜；從

9、平板上挑取單菌落,接種于5mL LB中(含100μg/mL Amp),然后于30℃搖床振蕩12h,成為活化一級發(fā)酵種子；取活化菌種,按1:50接種量接種于盛有300mL的LB的三角搖瓶中(含100μg/mL Amp),在空氣浴搖床中,30℃、200r/min振蕩培養(yǎng)12h,即為二級發(fā)酵種子液:發(fā)酵培養(yǎng)基選用LB-2×YT,體積均為3.0L,加3mL食用油作為防泡劑,在120℃滅菌20min后冷卻至30℃；加Amp10g,接種子液300m

10、L:細(xì)菌接種后30℃進(jìn)行基礎(chǔ)培養(yǎng)的時間為7h,以10mL/h的速度開始流加補(bǔ)料培養(yǎng)基,隨后流加速度以10mL/h逐漸遞加；于42℃加入誘導(dǎo)培養(yǎng)6h。pH由1mol/L HCl與25％氨水控制于7.0,空氣流量為1vvm,溶氧控制始終大于50％,攪拌轉(zhuǎn)速控制為800-1200r/min；經(jīng)15％的SDS-PAGE電泳圖像分析系統(tǒng)掃描分析,目的蛋白占到全菌總蛋白的38.4％,菌體干重達(dá)到14.28±0.11g/L。本研究建立并優(yōu)化了Krin

11、gle5蛋白的原核高密度發(fā)酵工藝,為其新藥開發(fā)奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。
　　 3基因重組Kringle5蛋白的純化工藝研究
　　 固定金屬親和層析(IMAC)是近年來發(fā)展起來的一種親和方法,其固定相基質(zhì)上鰲合了一些金屬離子,如Cu2+、Ni2+、Fe3+等,其配基為側(cè)鏈含有Lys、Met、Asp、Arg、Tyr、Glu和His的多肽,特別是肽序列中含有His-X-X-X-His的結(jié)構(gòu)最易結(jié)合到金屬離子親和柱上,純化效果較好。本課

12、題中,Kringle5的純化方法的設(shè)計是基于其N端設(shè)計有6個His組成的His標(biāo)簽。His的咪唑環(huán)作為電子供體容易與固定的金屬離子形成配位鍵,含有連續(xù)His殘基序列的多肽可在IMAC中有效保留?；|(zhì)材料洗滌之后可通過調(diào)節(jié)柱緩沖液的pH或添加游離咪唑洗脫含多聚His的多肽。本研究分別使用Chelating Sepharose Fast Flow填料,鰲合NiSO4后,利用Pharmacia Biotech GradiFrac控制臺,分別采

13、用pH梯度洗脫和咪唑梯度洗脫的方法探究了Kringle5的純化方法。本實驗中我們對兩種不同的目的蛋白洗脫的方法進(jìn)行了研究,我們優(yōu)選pH梯度洗脫法對Kringle5進(jìn)行純化。
　　 研究結(jié)果顯示,用10倍柱體積的Binding Buffer E洗至基線平穩(wěn)；將樣品加到層析柱中,室溫靜止30min后流速控制在15ml/h左右,收集穿透部分；層析用5倍柱體積(約50ml)的Binding Buffer E洗,流速控制在30ml/h左右

14、；分別用5倍柱體積(約50ml)ElutingBuffer F,Eluting Buffer G,Eluting Buffer H洗脫,流速控制在15ml/h左右,監(jiān)測A280并收集洗脫液；經(jīng)SDS-PAGE鑒定發(fā)現(xiàn),上樣峰中前部分為穿透峰,后半部分為非特意結(jié)合雜蛋白峰,洗脫峰均為Kringle5,蛋白純度在98％以上,pH梯度洗脫的蛋白得率為62.7mg/柱體積。本研究建立的Kringle5純化方法為后續(xù)Kringle5蛋白的生物學(xué)活

15、性研究奠定了實驗基礎(chǔ)。
　　 4基因重組Kringle5蛋白的藥效學(xué)研究
　　 纖溶酶原Kringle5能抑制內(nèi)皮細(xì)胞增生,且其活性比血管抑素(即Kringlel-4,angiostatin)更強(qiáng)。Kringle5抑制血管生長因具有高效、高細(xì)胞選擇性以及短的氨基酸序列的特點,而具有治療血管增生性疾病的潛在臨床應(yīng)用價值。
　　 4.1基因重組Kringle5抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的實驗研究
　　 本研究采用體

16、外實驗的方法用Kringle5和血管抑素干預(yù)VEC-304的生長,觀察我室制備的原核表達(dá)Kringle5重組蛋白的藥效學(xué)效果。實驗結(jié)果顯示:①本研究獲得的基因重組Kringle5蛋白抑制VEC-300的ED50為0.25(0.06,0.88)μmol/L;②從Kringle5對VEC-304細(xì)胞結(jié)構(gòu)的影響、對DNA的斷裂作用、細(xì)胞膜和細(xì)胞核的變化、細(xì)胞周期的改變和Procaspase3的表達(dá)變化等5個方面的研究結(jié)果顯示,Kringle5

17、處理的VEC-304細(xì)胞表面微絨毛表現(xiàn)為脫落或消失；形成了顯著的DNA Ladder且初步結(jié)果顯示Kringle5的致凋亡作用有劑量依賴性；作用于VEC-30412h后出現(xiàn)為早期凋亡,作用3d后出現(xiàn)細(xì)胞核固縮、裂解；凋亡細(xì)胞的百分率、G0/G1期細(xì)胞數(shù)隨Kringle5濃度的遞增而增加,細(xì)胞被阻滯于G0/G1期；Kringle5蛋白對VEC-304細(xì)胞的致凋亡作用有時間依賴性,在作用4h后即出現(xiàn)凋亡的跡象,8—12h達(dá)到最大。證實了本工

18、藝制備的基因重組Kringle5蛋白對血管內(nèi)皮細(xì)胞的致凋亡作用。⑨采用Caspase3抗體等對其機(jī)制進(jìn)行了研究,證實Kringle5誘導(dǎo)VEC-304細(xì)胞凋亡可能通過激活胞內(nèi)的Caspase3介導(dǎo)的凋亡途徑和阻遏細(xì)胞循環(huán)兩條途徑實現(xiàn)的。本研究為基因重組Kringle5蛋白的臨床應(yīng)用奠定了理論基礎(chǔ)。
　　 4.2基因重組Kringle5蛋白抑制內(nèi)皮細(xì)胞遷移的實驗研究
　　 腫瘤組織內(nèi)新生血管形成是由刺激血管生長因子誘導(dǎo)血管

19、內(nèi)皮細(xì)胞增殖和游走運動,從而誘生血管芽生成。內(nèi)皮細(xì)胞作為血管形成因子的效應(yīng)細(xì)胞,在腫瘤血管形成中起關(guān)鍵性的作用,所以對內(nèi)皮細(xì)胞的增殖或遷移的干擾能力是有效的抗血管形成藥物的重要特征。本研究采用缺損閉合實驗、誘導(dǎo)VEC-304細(xì)胞遷移實驗和體外血管形成實驗檢測Kringle5抑制VEC-304細(xì)胞遷移和體外血管形成效果,為其臨床應(yīng)用奠定實驗基礎(chǔ)。
　　 本研究結(jié)果顯示,100μmol/L的Kringle5作用后4d和6d兩組缺損面

20、積的差異具有顯著性,隨著干預(yù)時間的延長,缺損周圍的VEC-304細(xì)胞在向缺損生長,但是Kringle5組的缺損面積卻沒有增大；加入條件培養(yǎng)基對內(nèi)皮細(xì)胞作用6 h后,用U14細(xì)胞制備條件培養(yǎng)基1表現(xiàn)出對內(nèi)皮細(xì)胞更強(qiáng)的吸引作用,細(xì)胞計數(shù)顯著高于含有Kringle5蛋白的條件培養(yǎng)基,其抑制U14細(xì)胞條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)的VEC-304細(xì)胞遷移的ED50為70.60(56.05,91.85)μmol/L；Kdngle5蛋白抑制VEC-304細(xì)胞遷移的

21、ED50為36.44μmol/L；當(dāng)有U14細(xì)胞存在時,遷移的細(xì)胞數(shù)明顯增加,Kringle5蛋白使遷移細(xì)胞數(shù)顯著減少,并呈劑量依賴性,Kringle5蛋白抑制U14細(xì)胞誘導(dǎo)的VEC-304細(xì)胞遷移的ED50為13.04(3.86,33.81)μmol/L；體外血管形成試驗中,Kringle5組中VEC-304細(xì)胞形成的網(wǎng)格結(jié)構(gòu)較小且有較多的VEC-304細(xì)胞并未參與形成網(wǎng)格結(jié)構(gòu)而置于網(wǎng)格之間。說明Kringle5蛋白具有抑制血管生成的

22、作用,其作用機(jī)制可能是通過抑制內(nèi)皮細(xì)胞遷移和內(nèi)皮細(xì)胞增殖,從而抑制新生血管生成。
　　 4.3基因重組Kringle5蛋白對小鼠轉(zhuǎn)移瘤的治療效果評價
　　 人們已致力于開發(fā)和研究破壞或抑制血管生成、有效地阻止腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的藥物,這類藥物可切斷腫瘤賴以生長和轉(zhuǎn)移的營養(yǎng)來源和遷移通道,具有良好的特異性、劑量小、療效高、不易產(chǎn)生耐藥性、對正常組織毒性極小等優(yōu)點。本研究采用U14細(xì)胞懸液皮下種植建立小鼠移植瘤模型,將Kring

23、le5蛋白直接在瘤體內(nèi)注射,觀察瘤體大小,小鼠活動能力、飲食等狀況,以此來評價Kringle5蛋白治療的抑瘤能力,為其臨床應(yīng)用奠定實驗基礎(chǔ)。
　　 本研究結(jié)果顯示,治療各組小鼠治療前后飲食、行為無明顯異常,反應(yīng)能力、營養(yǎng)狀況良好；而陰性對照組小鼠隨著瘤體的增大,飲食、活動能力、反應(yīng)能力逐漸變差,營養(yǎng)差,后期呈惡病質(zhì)態(tài),在給藥后第6天有1只小鼠死亡。初步說明本研究用Kringle5在荷瘤小鼠體內(nèi)未引起明顯的免疫反應(yīng),且對小鼠的生長

24、狀態(tài)有一定的改善作用。①從瘤體的生長速度分析,各治療組瘤體在治療后第5d增長速度即開始減慢,10d后體積增長明顯減慢,第20d時Kringle5低劑量組和Kringle5高劑量組瘤體體積分別為(20270.00±527.18)mm3、(11993.33±229.75)mm3,其中低劑量組與Angiostatin組無顯著性差異(P>0.05),而高劑量組的治療效果優(yōu)于Angiostatin組(P<0.01)；Kringle5高劑量+環(huán)磷酰

25、胺組的瘤體體積為(7298.33±496.12)mm3,顯著低于其他各組(P<0.01),說明Kringle5在腫瘤化療的過程中與化療藥物同時使用效果可達(dá)最佳,且可減少化療藥物的副作用的發(fā)生。②從瘤體的重量角度分析,Kringle5低劑量組和Kringle5高劑量組瘤體重量分別為(4.78±1.34)g、(3.82±1.16)g,其中低劑量組與Angiostatin組的抑瘤效果相似(P>0.05),而高劑量組的治療效果優(yōu)于Angiost

26、atin組(P<0.01)；Kringle5高劑量+環(huán)磷酰胺組的瘤體重量為(3.16±1.08)g,顯著低于其他各組(P<0.01),說明Kringle5可抑制瘤體腫瘤細(xì)胞的增殖,其機(jī)制可能是減少瘤體組織的血供、促進(jìn)瘤細(xì)胞的凋亡而致。③從瘤體中血管形成的角度分析,使用CD31單抗檢測U14移植瘤中血管的形成和生長情況,可見陰性對照組(A組)的小鼠瘤體內(nèi)有分布不
　　 一、管腔不等的血管形成,而Kringle5高劑量組(D組)的血

27、管形成明顯減少,提示Kringle5具有抑制瘤體中血管新生的作用。
　　 對瘤體組織中相關(guān)基因的表達(dá)檢測結(jié)果顯示,Kringle5可抑制VEGF、IL-8的表達(dá),說明在使用Kringle5治療腫瘤中可降低腫瘤中血管生長刺激因子的表達(dá),對血管的新生有抑制作用,該結(jié)果與CD31單抗檢測瘤體組織血管分布相一致,初步說明Kringle5的抑瘤作用是通過抑制血管新生來實現(xiàn)的。Kringle5可抑制MMP-2、MMP-9的表達(dá),而促進(jìn)TIM

28、P-1、TIMP-2的合成,說明在使用Kringle5治療腫瘤中可同時降低腫瘤細(xì)胞的侵襲能力,在抑制腫瘤侵襲周圍正常組織中可能會起到重要作用。Kringle5蛋白可使瘤體中VE-cadherin表達(dá)量增加,而CD44V6的表達(dá)量減低,初步顯示Kringle5蛋白可能在腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的過程中起重要的抑制作用。本研究闡明了Kringle5抑制小鼠移植瘤生長的效果和可能機(jī)制,為其臨床應(yīng)用奠定了實驗基礎(chǔ)。
　　 5基因重組Kringle5

29、蛋白的毒理學(xué)研究
　　 本研究利用小鼠急性經(jīng)口毒性試驗、鼠傷寒沙門氏菌回復(fù)突變試驗、小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核試驗、小鼠精子畸形試驗、大鼠30d喂養(yǎng)試驗等毒理學(xué)試驗方法檢測基因重組Kringle5蛋白在動物體內(nèi)的急性毒性、致突變作用和較長期接觸毒性,為基因重組Kringle5蛋白的臨床應(yīng)用奠定實驗基礎(chǔ)。
　　 本研究結(jié)果顯示,基因重組Kringle5蛋白對兩種性別的SPF級昆明種小鼠的經(jīng)口毒性試驗中,二次灌胃總量達(dá)12.0

30、g/kg·bw,一周內(nèi)動物未見中毒癥狀,無動物死亡,按急性毒性分級標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定,基因重組Kringle5蛋白屬實際無毒級。小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核試驗、小鼠精子畸形試驗、鼠傷寒沙門氏菌回復(fù)突變試驗三項致突變試驗結(jié)果均為陰性,說明基因重組Kringle5蛋白無致突變作用。Wistar大鼠30d喂養(yǎng)試驗結(jié)果表明:該受試物0.34、3.40、6.70g/kg·bw劑量分別相當(dāng)于推薦人群日攝人量0.2g/kg·bw的20、50、100倍對Wista