重組融合蛋白rMBP-NAP的毒理學(xué)研究.pdf

1、幽門(mén)螺旋桿菌中性粒細(xì)胞激活蛋白(Hp-NAP)與大腸桿菌的麥芽糖結(jié)合蛋白（MBP）通過(guò)基因工程等技術(shù)融合得到的新型重組蛋白rMBP-NAP，研究發(fā)現(xiàn)該蛋白在通過(guò)免疫療法治療癌癥和其他與免疫異常相關(guān)的疾病時(shí)，有一定的效果，因此，重組融合蛋白rMBP-NAP可以作為一種新型的免疫調(diào)節(jié)候選藥物。本課題通過(guò)一系列試驗(yàn)，包括rMBP-NAP的急性毒性試驗(yàn)、rMBP-NAP的90天長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)、rMBP-NAP的小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核試驗(yàn)和鼠傷寒

2、沙門(mén)氏菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)，對(duì)rMBP-NAP的安全性進(jìn)行評(píng)價(jià)。本研究主要包括以下幾個(gè)方面：
　　（1）融合蛋白rMBP-NAP的制備
　　將實(shí)驗(yàn)室前期已有的工程菌E.coli TB1(pMAL-c2x-napA)在37℃搖床培養(yǎng)，加入誘導(dǎo)劑IPTG誘導(dǎo)3h產(chǎn)生融合蛋白rMBP-NAP，低溫離心大量收集菌體后進(jìn)行超聲破碎，取超聲低溫離心后的上清進(jìn)行SDS-PAGE蛋白電泳，驗(yàn)證融合蛋白rMBP-NAP的可溶性，然后采用親和層析方法

3、純化融合蛋白rMBP-NAP，將純化后的蛋白用PBS透析，并采用BCA蛋白定量法和Iamge J2X對(duì)純化后的融合蛋白rMBP-NAP分別定量和測(cè)定純度。
　　（2）rMBP-NAP的急性毒性試驗(yàn)
　　根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，采用最大耐受量法（MTD）對(duì)小鼠尾靜脈注射rMBP-NAP。小鼠按照性別隨機(jī)分為兩組，其中給藥組20只，PBS陰性對(duì)照組10只，給藥組最大給藥劑量125mg/kg是治療劑量的25倍。給藥后連續(xù)觀察7天并做記錄。

4、結(jié)果表明直至給藥期結(jié)束沒(méi)有出現(xiàn)小鼠死亡，給藥期間沒(méi)有異常的活動(dòng)情況。處死小鼠后對(duì)小鼠進(jìn)行解剖并觀察，沒(méi)有出現(xiàn)明顯的病變器官。
　?。?）rMBP-NAP的長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)
　　根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，將給大鼠靜脈注射不同劑量的融合蛋白rMBP-NAP。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為三組，rMBP-NAP給藥組21mg/kg、42mg/kg和PBS陰性對(duì)照組。連續(xù)尾靜脈給藥90天觀察大鼠毒性反應(yīng)。90天給藥期結(jié)束后處死部分大鼠，取血樣和主要器官檢測(cè)，其

5、余大鼠在30天恢復(fù)期后處死做同樣處理。結(jié)果顯示給藥期大鼠體重與對(duì)照組相比有明顯差異，血常規(guī)無(wú)影響，給藥組的血液生化指標(biāo)和組織病理學(xué)結(jié)果顯示，肝、腎可能為毒性靶器官。受試動(dòng)物在經(jīng)過(guò)30天恢復(fù)期后各項(xiàng)指標(biāo)基本恢復(fù)正常。
　?。?）rMBP-NAP的小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核試驗(yàn)
　　隨機(jī)將50只昆明鼠分為5組，雌雄各半，分別為陰性PBS對(duì)照組，陽(yáng)性環(huán)磷酰胺對(duì)照組，rMBP-NAP給藥組為5mg/kg、25mg/kg和50mg/kg

6、，連續(xù)5天尾靜脈給藥，末次給藥24h后處死小鼠，制骨髓細(xì)胞片染色計(jì)數(shù)。結(jié)果表明rMBP-NAP給藥組微核率與陰性對(duì)照組相比無(wú)明顯差異。
　?。?）rMBP-NAP的鼠傷寒沙門(mén)氏菌回復(fù)突變實(shí)驗(yàn)
　　設(shè)計(jì)四個(gè)劑量受試藥物分別為50μg/每皿、200μg/每皿、1000μg/每皿和4000μg/每皿，均包括加S9和不加S9兩種情況。用測(cè)試菌株TA97，TA98，TA100，TA102檢測(cè)，結(jié)果表明，rMBP-NAP在200~400