p300 100kD降解片段通過μ型鈣蛋白酶產(chǎn)生并促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞分化發(fā)育.pdf

1、神經(jīng)發(fā)育是一個(gè)通過大量基因在時(shí)間和空間上非常精密地表達(dá)而被調(diào)控的復(fù)雜過程。這些基因的表達(dá)異?？蓪?dǎo)致神經(jīng)發(fā)育紊亂。染色質(zhì)結(jié)構(gòu)能夠整合細(xì)胞內(nèi)、外環(huán)境的信息引發(fā)特定的表型產(chǎn)生，是一種調(diào)節(jié)基因精確表達(dá)的關(guān)鍵機(jī)制。組蛋白乙酰化酶（histone acetyltransferases，HATs）是以空間和時(shí)間依賴性形式調(diào)控基因表達(dá)水平的蛋白家族之一，其通過乙?；揎椬饔每墒谷旧|(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生動(dòng)態(tài)改變，并對(duì)基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生相應(yīng)的影響。p300作為一種HAT

2、，調(diào)控全身各組織中多種基因的轉(zhuǎn)錄活性，特別在細(xì)胞周期進(jìn)程和細(xì)胞分化中發(fā)揮重要功能。除了具有乙酰轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域，p300還含有許多保守功能結(jié)構(gòu)域通過與其它細(xì)胞蛋白相互作用。p300的基本功能是作為HAT或FAT，以及充當(dāng)轉(zhuǎn)錄因子和基本轉(zhuǎn)錄裝置中其它原件之間的三角架及橋架，易化染色質(zhì)重構(gòu)并激活基因轉(zhuǎn)錄，能對(duì)神經(jīng)元中p53羧基末端特異賴氨酸位點(diǎn)乙?；龠M(jìn)突起的生長(zhǎng)并為軸突再生所必需。p300與另一種HAT即CREB結(jié)合蛋白（CREB-bind

3、ing protein，CBP）非常相似，二者對(duì)細(xì)胞周期調(diào)控、凋亡、胚胎發(fā)育、細(xì)胞分化和腫瘤發(fā)生等多種活動(dòng)都有影響，并是胚胎發(fā)育，特別是神經(jīng)發(fā)育中均是必不可少的調(diào)控因子。然而，二者也具有一些不同的功能，p300在神經(jīng)分化發(fā)育中的作用不能被CBP所替代。
　　盡管p300在胚胎干細(xì)胞和畸胎瘤細(xì)胞F9細(xì)胞分化中必不可少，但是，在誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞擬胚胎形成的分化時(shí)，p300 mRNA水平升高但其蛋白水平下降；在視黃酸（retinoic a

4、cid，RA）誘導(dǎo)F9分化過程中，p300的HAT活性顯著增加，但其蛋白水平卻顯著降低，表明在分化過程中p300被大量降解。p300蛋白水平下降與泛素蛋白酶體系統(tǒng)降解有關(guān)，但p300下降后伴隨的HAT活性增強(qiáng)促進(jìn)細(xì)胞分化是否與泛素蛋白酶體系統(tǒng)途徑降解有關(guān)尚不確定。在急性髓性白血病中，CBP/p300發(fā)生降解，而鈣蛋白酶的特異性抑制劑能夠阻斷 CBP/p300的下降，表明p300可被鈣蛋白酶降解。
　　本研究在證明小鼠腦組織和小鼠成

5、神經(jīng)瘤細(xì)胞（N2a細(xì)胞）分化發(fā)育過程中p300 mRNA表達(dá)逐漸增加而全長(zhǎng)p300蛋白逐漸減少的基礎(chǔ)上，首次檢測(cè)到在神經(jīng)元分化過程中，p300可被μ型鈣蛋白酶特異性剪切而產(chǎn)生大量的約100kD大小的氨基末端片段，并初步證明該片段具有比全長(zhǎng)p300更強(qiáng)的促神經(jīng)細(xì)胞分化作用。
　　1.小鼠胚腦和 N2a細(xì)胞分化發(fā)育過程中p300水平逐漸下降為了明確在神經(jīng)系統(tǒng)分化發(fā)育過程中存在p300轉(zhuǎn)錄水平升高的同時(shí)蛋白水平下降這一現(xiàn)象，首先，我們提

6、取E9.5至E16.5小鼠胚胎全腦的蛋白，檢測(cè)小鼠胚胎腦分化發(fā)育過程中 p300蛋白水平的變化趨勢(shì)。結(jié)果顯示，在小鼠胚胎 E9.5至 E15.5期間，p300的蛋白水平則逐漸下降。繼而，我們對(duì)N2a細(xì)胞用RA誘導(dǎo)分化0-48h后，應(yīng)用RT-PCR和Western blot技術(shù)檢測(cè)到p300 mRNA和蛋白水平，發(fā)現(xiàn)隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，p300 mRNA逐漸升高而蛋白質(zhì)水平下降。以上結(jié)果說明，在神經(jīng)組織或神經(jīng)細(xì)胞分化發(fā)育過程中，同樣存在p

7、300轉(zhuǎn)錄水平升高同時(shí)蛋白表達(dá)水平下降現(xiàn)象。
　　2.小鼠胚腦和 N2a細(xì)胞分化發(fā)育過程中全長(zhǎng) p300蛋白水平下降而 p300100kD裂解片段升高在小鼠胚腦和N2a細(xì)胞分化發(fā)育過程中，p300表達(dá)水平逐漸下降的現(xiàn)象體提示，p300在神經(jīng)分化中可能被大量降解。為此，應(yīng)用識(shí)別p300氨基末端的抗體對(duì)不同胚齡小鼠腦組織和經(jīng) RA誘導(dǎo)不同時(shí)間的N2a細(xì)胞中全長(zhǎng)p300（full length p300, FL-p300）及其降解產(chǎn)物的

8、水平變化情況進(jìn)行Western blot檢測(cè)。結(jié)果顯示，在約100kD大小處可見一明顯降解片段——p300100kD片段（100kD fragment of p300,100kD p300）。該降解片段水平在E9.5至E12.5腦中以及RA誘導(dǎo)分化的0至2d的N2a細(xì)胞中隨著FL-p300水平的逐漸降低而上升；在E13.5至E16.5期間，則與FL-p300同步下降。
　　3.產(chǎn)生100kD p300的裂解位置在p300氨基酸72

9、6-1020區(qū)域100kD p300能被識(shí)別 p300氨基末端的抗體識(shí)別，根據(jù)分子量計(jì)算其產(chǎn)生位置應(yīng)在 p300氨基末端1/3處。由于p300的同源蛋白CBP在細(xì)胞分化過程中沒有類似于p300基因轉(zhuǎn)錄增加而蛋白水平降低的現(xiàn)象，且盡管CBP和p300的序列一致性高達(dá)60％，但在氨基末端1/3處二者序列相似度很低，因此我們以同源蛋白CBP做對(duì)照來確定100kD p300的裂解位置。根據(jù)CBP和p300的氨基末端1/3處可能裂解位置處的氨基酸

10、序列，構(gòu)建表達(dá)FL-p300裂解位點(diǎn)競(jìng)爭(zhēng)性底物的質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染N2a后用RA誘導(dǎo)36h。Western blot檢測(cè)顯示，轉(zhuǎn)染表達(dá)CBP(aa777-974)短片段（CBP short fragment，CBP S）和CBP（aa726-1020）長(zhǎng)片段（CBP long fragment，CBP L）的細(xì)胞，100kD p300的產(chǎn)生與轉(zhuǎn)染表達(dá)HA的細(xì)胞無明顯區(qū)別，而轉(zhuǎn)染表達(dá)p300（aa777-974）短片段（p300 short fr

11、agment，p300 S）和p300（aa726-1020）長(zhǎng)片段（p300 long fragment，p300 L）的細(xì)胞，100kD p300的產(chǎn)生較轉(zhuǎn)染表達(dá)HA的細(xì)胞減少，即p300 S和p300 L能抑制RA誘導(dǎo)分化過程中100kD p300的產(chǎn)生，且以p300 L的抑制作用更明顯。對(duì) RA誘導(dǎo) N2a細(xì)胞突起生長(zhǎng)（神經(jīng)細(xì)胞分化的標(biāo)志之一）作用的比較顯示，p300 S和p300 L對(duì)RA誘導(dǎo)的N2a突起生長(zhǎng)也具有抑制作用，并

12、以p300 L的抑制作用更顯著。由此表明，產(chǎn)生100 kD p300的裂解位置在p300氨基酸726-1020區(qū)域，并提示p300在此區(qū)域的裂解可促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的分化。
　　4.μ型鈣蛋白酶是產(chǎn)生100kD p300的剪切酶為了尋找產(chǎn)生100kD p300的剪切酶，首先觀察了蛋白酶體抑制劑MG132和鈣蛋白酶抑制劑calpeptin對(duì)分化誘導(dǎo)N2a細(xì)胞產(chǎn)生100kD p300的影響。在5%FBS完全培養(yǎng)基培養(yǎng)的未分化N2a細(xì)胞中，M

13、G132和calpeptin對(duì)p300的降解和100 kD p300的產(chǎn)生沒有影響，而在含RA培養(yǎng)基培養(yǎng)的N2a細(xì)胞中，MG132雖可阻斷p300的降解，卻不影響100kD p300的產(chǎn)生；而calpeptin抑制FL-p300降解的同時(shí)也抑制了100kD p300的產(chǎn)生。由此說明calpain是100kD p300產(chǎn)生的剪切酶。
　　根據(jù)激活時(shí)所需 Ca2+濃度數(shù)量級(jí)不同，鈣蛋白酶家族分為μ型鈣蛋白酶（微摩爾級(jí)）和m型鈣蛋白酶（

14、毫摩爾級(jí)）兩類。為了明確μ型鈣蛋白酶和m型鈣蛋白酶對(duì)p300的剪切及100kD p300的產(chǎn)生是否具有不同的影響，使用5μmol/L和5 mmol/L兩種數(shù)量級(jí)濃度的Ca2+分別激活體外的μ型鈣蛋白酶和m型鈣蛋白酶來比較兩種鈣蛋白酶對(duì)小鼠E13.5胚胎全腦蛋白中p300裂解的差異。免疫印跡技術(shù)檢測(cè)顯示，隨著濃度的升高，m型鈣蛋白酶雖然可促進(jìn)FL-p300裂解，但對(duì)100kD p300的產(chǎn)生沒有影響，而μ型鈣蛋白酶既可促進(jìn)FL-p300的

15、裂解也可促進(jìn)100kD p300的形成，其最適濃度范圍為0.01 U/μl~0.02 U/μl。當(dāng)在加入0.003 U/μl或0.01 U/μl的μ型鈣蛋白酶同時(shí)加入10μmol/L calpeptin，對(duì)FL-p300的剪切被明顯抑制，尤其是對(duì)0.01 U/μlμ型鈣蛋白酶抑制效果更為明顯。因此，μ型鈣蛋白酶是產(chǎn)生100kD p300的剪切酶。
　　在N2a細(xì)胞轉(zhuǎn)染表達(dá)氨基末端鏈接標(biāo)簽HA的p300后提取蛋白，用μ型鈣蛋白酶進(jìn)行

16、酶切，用HA標(biāo)簽抗體進(jìn)行Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，μ型鈣蛋白酶剪切p300產(chǎn)生的100kD p300片段帶有HA標(biāo)記，加入calpeptin可抑制帶HA的100kD片段產(chǎn)生。因此，μ型鈣蛋白酶對(duì)p300進(jìn)行剪切的位點(diǎn)位于p300氨基末端1/3處。
　　進(jìn)一步應(yīng)用Western blot對(duì)發(fā)育過程中小鼠胚胎腦蛋白中μ型鈣蛋白酶水平的變化進(jìn)行檢測(cè)顯示，從E9.5至E15.5，腦內(nèi)μ型鈣蛋白酶激活型大亞基水平逐漸升高，表明胚胎發(fā)

17、育過程中100kD p300產(chǎn)生的逐漸增加與μ型鈣蛋白酶活性逐漸增強(qiáng)有關(guān)。
　　5.100kD p300促進(jìn)N2a細(xì)胞的分化發(fā)育為了了解分化發(fā)育中FL-p300被剪切產(chǎn)生100kD片段的可能功能意義，繼而分析了過表達(dá)不同p300片段對(duì)N2a細(xì)胞分化發(fā)育的影響。結(jié)果顯示，過表達(dá)p300氨基末端片段（aa9-1007，p300 N）能顯著促進(jìn)N2a細(xì)胞突起的生長(zhǎng)和GAP43蛋白水平上升；過表達(dá)p300羧基末端片段（aa1006-241

18、4，p300 C）可促進(jìn)N2a細(xì)胞中p53乙?；?，但對(duì)N2a細(xì)胞突起生長(zhǎng)和GAP43蛋白水平上升無明顯影響。而共同過表達(dá)p300 N和p300 C，其促進(jìn)突起生長(zhǎng)和 GAP43蛋白水平上升的作用較弱，與過表達(dá)全長(zhǎng) p300類似或略弱于全長(zhǎng)p300，明顯弱于p300 N；促進(jìn)p53乙?；淖饔脧?qiáng)于全長(zhǎng)p300，但明顯低于p300 C。由此表明，p300促進(jìn)神經(jīng)分化的功能主要由p300氨基末端100kD片段完成，p300羧基末端片段具有較強(qiáng)