細(xì)胞骨架和鈣蛋白酶在脊髓背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元細(xì)胞急性壓力損傷中的作用.pdf

1、急性脊髓損傷是骨科臨床常見病癥,以中青年胸腰段損傷最為常見。由于神經(jīng)損傷的不可逆性,使脊髓損傷治療困難,致殘率高,給社會及家庭帶來沉重的負(fù)擔(dān)。據(jù)研究報(bào)告顯示,創(chuàng)傷性脊髓損傷在美國每百萬人口中的發(fā)生率為28到55人,而且每年有一萬的新增病例發(fā)生。近年來脊髓損傷的病理機(jī)制及修復(fù)再生方面取得了一些進(jìn)展,但原發(fā)性脊髓損傷機(jī)制仍不清楚。研究脊髓神經(jīng)細(xì)胞急性損傷的反應(yīng)機(jī)制及超微結(jié)構(gòu)變化,在脊髓損傷的早期進(jìn)行細(xì)胞干預(yù)保護(hù),減輕神經(jīng)細(xì)胞進(jìn)一步病理損害是

2、目前認(rèn)為最可行的治療方法。
　　目的:通過脊髓背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元細(xì)胞的體外培養(yǎng)及機(jī)械壓力加載損傷模型,系統(tǒng)觀察細(xì)胞骨架及胞膜皮層骨架蛋白在機(jī)械壓力損傷及傳導(dǎo)中的變化及作用,探索細(xì)胞骨架、鈣蛋白酶及細(xì)胞凋亡之間的關(guān)系,同時(shí)應(yīng)用新型鈣蛋白酶抑制劑,觀察該抑制劑在神經(jīng)細(xì)胞機(jī)械壓力損傷中的保護(hù)作用。
　　材料與方法:本課題通過體外培養(yǎng)新生S-D大鼠脊髓背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元細(xì)胞,利用專用細(xì)胞壓力儀器裝置(國家實(shí)用新型專利,專利號ZL2008

3、20030390.7)加載機(jī)械壓力損傷,機(jī)械壓力損傷值分為空白對照、0.3mpa組、0.5mpa組、0.7mpa組,分別在損傷后培養(yǎng)8小時(shí)及24小時(shí)觀察檢測分析,排除急性脊髓損傷時(shí)的其他干擾致傷因素,采用激光共聚焦顯微鏡、細(xì)胞免疫組織化學(xué)、原子力顯微鏡、細(xì)胞凋亡檢測(TUNEL)等技術(shù),觀察不同損傷條件下細(xì)胞骨架及胞膜皮層骨架蛋白的變化情況。探索脊髓損傷的單純壓力因素對神經(jīng)元細(xì)胞的損傷機(jī)制,尤其是細(xì)胞骨架的變化情況及細(xì)胞凋亡的發(fā)生。同時(shí)

4、應(yīng)用新型鈣蛋白酶抑制劑,觀察在機(jī)械壓力加載損傷下的細(xì)胞保護(hù)效應(yīng)。闡明機(jī)械壓力損傷的細(xì)胞機(jī)械信號傳導(dǎo)的機(jī)制及參與結(jié)構(gòu),進(jìn)一步認(rèn)識原發(fā)性脊髓損傷的反應(yīng)機(jī)制,并為急性脊髓損傷的早期干預(yù)提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。
　　結(jié)果:(1)培養(yǎng)的脊髓背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元原始細(xì)胞懸液于四小時(shí)后貼壁,初始貼壁的細(xì)胞呈形態(tài)均一的小圓形,培養(yǎng)24小時(shí)后細(xì)胞特征性形態(tài)形成,可見典型長突觸及橢圓形胞體。(2)阿糖胞苷純化可得到純度大于90％的神經(jīng)元細(xì)胞。(3)空白對

5、照組神經(jīng)元微管蛋白分布均勻連續(xù),沿突觸方向連續(xù)伸展,無斷裂及打結(jié)纏繞現(xiàn)象?？捡R斯亮藍(lán)細(xì)胞骨架染色可見胞內(nèi)分布均勻,呈網(wǎng)狀交織分布,無骨架的邊集與濃聚現(xiàn)象。(4)倒置顯微鏡觀察見0.5mpa組的細(xì)胞有明顯的漂浮生長現(xiàn)象,與培養(yǎng)皿壁脫離,且該組的骨架蛋白損害最明顯,凋亡染色亦最為明顯。(5)原子力顯微鏡觀察得到神經(jīng)元細(xì)胞表面的納米級分辨率的三維成像及顆粒數(shù)據(jù),為精確分析胞膜骨架蛋白的變化提供依據(jù)。(6)機(jī)械壓力損傷后細(xì)胞與對照組細(xì)胞比較,原

6、子力顯微鏡圖像及胞膜表面顆粒數(shù)據(jù)有明顯差異,且隨機(jī)械損傷值增加,表面蛋白顆粒高度值增加,粗糙度增高,與未損傷組比較有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。(7)0.7mpa損傷組胞膜出現(xiàn)多量明顯的離子孔道的開放,表明0.7mpa損傷值可能為神經(jīng)元細(xì)胞所能承受機(jī)械打擊的極限。(8)加入終濃度為100μmol/L的鈣蛋白酶抑制劑PD150606預(yù)處理后,與損傷未加保護(hù)組比較,細(xì)胞機(jī)械壓力損傷的破壞反應(yīng)明顯減輕,綜合免疫組化、凋亡染色及原子力顯微鏡觀察,表明鈣蛋白

7、酶抑制劑PD150606在機(jī)械壓力損傷脊髓神經(jīng)方面具有一定的保護(hù)作用。
　　結(jié)論:(1)本實(shí)驗(yàn)成功建立靜態(tài)機(jī)械壓力損傷神經(jīng)元細(xì)胞模型,細(xì)胞損傷以細(xì)胞骨架及胞膜皮層骨架的反應(yīng)為主要特征,參與介導(dǎo)了機(jī)械信號的生物學(xué)轉(zhuǎn)換。(2)神經(jīng)元細(xì)胞的機(jī)械壓力耐受值較低,0.5mpa可以造成明顯細(xì)胞損害,0.7mpa直接導(dǎo)致胞膜孔道樣結(jié)構(gòu)出現(xiàn)和細(xì)胞的死亡。(3)脊髓損傷早期的蛋白酶抑制劑應(yīng)用有明顯的神經(jīng)元細(xì)胞保護(hù)作用。(4)細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)和鈣蛋白酶的