GDNF促進(jìn)離體中腦DA能神經(jīng)細(xì)胞存活-分化的機制研究.pdf

1、膠質(zhì)細(xì)胞系源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(glia cell line-derived neurotrophic factor,GDNF)能有效的促進(jìn)中腦黑質(zhì)多巴胺(dopamine，DA)能神經(jīng)細(xì)胞的存活。通過糖基化磷酯?；?glycosylphosphatidylinositol，GPI)錨定的GDNF家族受體α1(GDNF family receptorα1，GFRα1)和跨膜的酪氨酸激酶受體RET，GDNF可以激活細(xì)胞內(nèi)兩條信號通路，即磷脂酰

2、肌醇3-激酶／Akt(phosphatidylinositol 3-kinase／Akt，PI3-K／Akt)信號通路和Ras／Raf／MEK/Erk信號通路。為探討在GDNF促進(jìn)中腦DA能神經(jīng)細(xì)胞存活／分化過程中，上述兩條信號通路及其下游信號分子的可能作用，本研究在建立GDNF促進(jìn)中腦DA能神經(jīng)細(xì)胞存活／分化的細(xì)胞培養(yǎng)模型和腦片培養(yǎng)模型的基礎(chǔ)上，采用組織化學(xué)的免疫特異性染色技術(shù)及western blot等方法，觀察DA合成的限速酶-酪

3、氨酸羥化酶(tyrosinehydroxylase，TH)的表達(dá)情況；同時，由于含鈣結(jié)合蛋白D28k(calbindin D28k，CB)的DA能神經(jīng)細(xì)胞具有較強的抗變性能力，而GDNF又能促進(jìn)DA能神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)CB的表達(dá)增加，因此，本研究也同時觀察了DA能神經(jīng)細(xì)胞中CB表達(dá)的變化，并以此作為GDNF促進(jìn)DA能神經(jīng)細(xì)胞存活／分化的指標(biāo)之一。在上述實驗基礎(chǔ)上，探討GDNF促進(jìn)DA能神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)TH、CB表達(dá)增加的分子機制。 結(jié)果顯示，

4、GDNF在促進(jìn)DA能神經(jīng)細(xì)胞存活／分化時，可以使Akt和Erk1／2的磷酸化水平增加；P13-K／Akt信號通路阻斷劑wortmannin可以阻斷GDNF促進(jìn)TH<'+>神經(jīng)細(xì)胞數(shù)目、突起數(shù)目、CB<'+>神經(jīng)細(xì)胞數(shù)目及TH、CB蛋白表達(dá)增加的作用；而Ras/Raf/MEK/Erk信號通路阻斷劑PD98059對GDNF的上述生物學(xué)效應(yīng)則沒有影響。表明是P13-K/Akt信號通路而不是Ras/Raf/MEK/Erk信號通路在GDNF促進(jìn)中

5、腦DA能神經(jīng)細(xì)胞存活/分化過程中起重要作用，而Ras/Raf/MEK/Erk信號通路則對我們選擇的促存活/分化指標(biāo)沒有作用，提示其可能參與GDNF對DA能神經(jīng)細(xì)胞的其他生物學(xué)作用。 由于P13-K/Akt信號通路主要為細(xì)胞漿內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，不能直接調(diào)節(jié)細(xì)胞核內(nèi)的基因表達(dá)。因此，本文進(jìn)一步探討P13-K/Akt信號通路下游轉(zhuǎn)錄因子核因子-κB(nuclearfactor-κB，NF-κB)在該過程中的作用。在靜息細(xì)胞內(nèi)，NF-κB

6、主要位于細(xì)胞漿；在一些信號分子的作用下，NF-κB被激活并從細(xì)胞漿轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核而調(diào)節(jié)與促進(jìn)細(xì)胞存活和抑制細(xì)胞凋亡有關(guān)的基因表達(dá)。結(jié)果顯示，GDNF在促進(jìn)DA能神經(jīng)細(xì)胞存活/分化時，可以使細(xì)胞內(nèi)NF-κB(p65)發(fā)生核轉(zhuǎn)位；NF-κB活性抑制劑 helenalin可以阻斷GDNF促進(jìn)TH<'+>神經(jīng)細(xì)胞數(shù)目、突起數(shù)目、CB<'+>神經(jīng)細(xì)胞數(shù)目及TH、CB蛋白表達(dá)增加的作用。提示，作為PI3-K/Akt下游的、并具有轉(zhuǎn)錄因子作用的信號分子