RNA干擾抑制N-cadherin表達(dá)對GDNF保護(hù)多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞作用的研究.pdf

1、目的:設(shè)計(jì)并篩選小鼠N-cadherin 基因有效RNA 干擾片段，構(gòu)建干擾質(zhì)粒；干擾抑制N-cadherin 基因表達(dá)，同時研究N-cadherin 基因表達(dá)降低時對GDNF 介導(dǎo)的MN9D 細(xì)胞突起生長和6-OHDA 誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的影響。
　　 方法:使用公用網(wǎng)站設(shè)計(jì)、篩選符合公開文獻(xiàn)篩選參數(shù)的序列3 條以及陰性對照序列1 條，由上海英俊技術(shù)有限公司合成。與pSilencer 3.1-H1 hygro 質(zhì)粒重組后，分別命名為

2、質(zhì)粒pSi-cad 1、pSi-cad 2、pSi-cad 3 和pSi-control。轉(zhuǎn)染大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞。陽性克隆經(jīng)DNA 測序鑒定后，用半定量RT-PCR 和Western blot 方法進(jìn)行靶點(diǎn)的篩選。篩選的N-cadherin 有效干擾質(zhì)粒pSi-cad 3 轉(zhuǎn)染多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞MN9D 細(xì)胞。接著檢測RNA 干擾后分別在GDNF 作用和6-OHDA 處理情況下細(xì)胞突起生長和凋亡率變化。干擾48 hr 后予GDNF 預(yù)處理

3、，IPP(Image Pro Plus)軟件測定細(xì)胞突起長度；干擾48 hr 后6-OHDA 誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，流式細(xì)胞儀測定轉(zhuǎn)染pSi-cad 3 質(zhì)粒和陰性對照質(zhì)粒及空白組細(xì)胞凋亡率。
　　 結(jié)果:DNA 測序鑒定顯示重組質(zhì)粒中含有所設(shè)計(jì)的寡核苷酸雙鏈，序列正確。轉(zhuǎn)染48h 后，陰性對照質(zhì)粒的MN9D 細(xì)胞中N-cadherin 表達(dá)未受影響，而轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pSi-cad 3 的MN9D細(xì)胞中N-cadherin 的mRNA及蛋白質(zhì)

4、表達(dá)水平顯著下降（50％），提示小干擾RNA 介導(dǎo)的N-cadherin 序列特異性基因沉默。在GDNF 介導(dǎo)MN9D細(xì)胞突起生長作用研究中，干擾組和陰性質(zhì)粒對照組及空白組平均細(xì)胞突起長度分別為，對照組和空白組分別為49.5 ± 7.9 μm、50.0 ± 7.1 μm，而干擾組降低為43.2± 5.9 μm。轉(zhuǎn)染48 h 后行6-OHDA 誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。流式細(xì)胞儀測定顯示，空白對照組和陰性質(zhì)粒對照組凋亡率為38.5 ％和39.0 ％，