Angiopoietin-1聯(lián)用L-mimosine對(duì)糖尿病大鼠腎臟缺氧及相關(guān)因子的影響.pdf

1、背景和目的：糖尿病腎臟存在慢性缺氧和異常的血管生成，且與血管生成調(diào)控因子失衡相關(guān)。前期實(shí)驗(yàn)已證實(shí)Angiopoietin-1（Ang-1）可改善糖尿病腎臟血管生成調(diào)控因子異常表達(dá)，一定程度上緩解糖尿病腎臟微血管病變。本課題通過(guò)Ang-1聯(lián)用低氧誘導(dǎo)因子（HIF）降解抑制劑（L-mimosine，L-mim），探討其對(duì)糖尿病腎臟缺氧及相關(guān)因子表達(dá)的影響。
　　方法：構(gòu)建Ang-1腺病毒表達(dá)載體（Ad-Ang-1）。使用鏈脲佐菌素（S

2、TZ）腹腔注射誘導(dǎo)構(gòu)建SD大鼠糖尿病模型。設(shè)正常對(duì)照組（N組）、糖尿病組（D組）、Ang-1+L-mim治療組（AL組）及空白載體組（K組）。AL組于糖尿病成模8周后經(jīng)陰莖靜脈給予Ad-Ang-1（3×108 pfu/只），并隔日腹腔注射L-mim（50mg/kg）；于12周、16周后采血觀察血糖、尿素、肌酐以及24小時(shí)尿蛋白變化；處死大鼠前1.5h靜脈注射缺氧探針（Hypoxyprobe?-1），取腎臟組織，免疫組化觀察缺氧情況，免疫

3、組化/熒光、免疫印跡（western bloting）和實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-PCR）檢測(cè)Ang-1、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）、HIF-1α、血紅素加氧酶-1（HO-1）表達(dá)變化。
　　結(jié)果：
　　1.三個(gè)糖尿病模型組血糖、24小時(shí)尿蛋白均明顯高于N組（P＜0.01），且AL組24小時(shí)尿蛋白低于D組、K組（P＜0.05）。
　　2.腎臟病理顯示三個(gè)糖尿病模型組可見(jiàn)不同程度腎小球增大、系膜基質(zhì)增多、細(xì)胞數(shù)增多、腎

4、小管擴(kuò)張，部分球囊擴(kuò)張、腎小管上皮細(xì)胞顆粒和空泡變性等，AL組病理改變相對(duì)減輕。
　　3.腎組織缺氧探針免疫組化顯示12周三個(gè)糖尿病模型組腎臟陽(yáng)性著染面積較N組明顯增大（P＜0.01），AL組陽(yáng)性著染面積較D組、K組明顯減?。≒＜0.01），且AL組16周陽(yáng)性著染面積小于12周（P＜0.05）。
　　4.免疫組化/熒光及蛋白印跡顯示：①Ang-1突出表達(dá)于腎小球及腎臟小血管，三個(gè)糖尿病模型組腎組織 Ang-1明顯上調(diào)（P＜0

5、.05），其中AL組16周時(shí)上調(diào)顯著高于D組和K組（P＜0.01）；②VEGF突出表達(dá)于腎小管上皮細(xì)胞，三個(gè)糖尿病模型組腎組織 VEGF顯著上調(diào)（P＜0.01），其中AL組上調(diào)明顯高于D組和K組（P＜0.05）；③HIF-1α主要表達(dá)于腎小管上皮細(xì)胞，三個(gè)糖尿病模型組腎組織HIF-1α均顯著上調(diào)（P＜0.01），16周時(shí)D組和K組較12周時(shí)明顯下調(diào)（P＜0.05）且顯著低于AL組（P＜0.01）；④HO-1主要表達(dá)于腎小管上皮細(xì)胞，三個(gè)

6、糖尿病模型組腎組織HO-1明顯上調(diào)（P＜0.05），其中AL組上調(diào)明顯高于D組和K組（P＜0.05）。
　　5. RT-PCR結(jié)果顯示:①三個(gè)糖尿病模型組腎組織Ang-1mRNA表達(dá)上調(diào)僅AL組顯著高于N組（P＜0.05）,且16周時(shí)明顯下調(diào)（P＜0.05）；②三個(gè)糖尿病模型組12周時(shí)腎組織VEGFmRNA表達(dá)上調(diào)僅AL組顯著高于N組（P＜0.05）,16周時(shí)表達(dá)均下調(diào)，但均無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；③三個(gè)糖尿病模型組腎組

7、織HIF-1αmRNA表達(dá)上調(diào)僅AL組顯著高于N組（P＜0.05）,且16周時(shí)仍高于D組、K組（P＜0.05）；④三個(gè)糖尿病模型組腎組織HO-1mRNA表達(dá)均較N組上調(diào)，但僅16周時(shí)AL組顯著高于N組和D、K組（P＜0.05）。
　　6.相關(guān)分析顯示:VEGF與Ang-1、HIF-1α表達(dá)變化呈正相關(guān)（r分別為：0.868、0.735，P均<0.05），三者表達(dá)變化與缺氧探針陽(yáng)性著染程度呈負(fù)相關(guān)（r分別為：-0.928、-0.95