Angiopoietin-1腺病毒載體構(gòu)建及其在糖尿病大鼠腎臟的表達(dá).pdf

1、目的：Angiopoietin-1（Ang-1）是新近發(fā)現(xiàn)的促血管生成因子，在生理和病理性血管生成、穩(wěn)定、減少血管滲漏等方面扮演著重要作用。糖尿病腎病很大程度與腎臟局部微血管病變和血管生成調(diào)控因子的失衡相關(guān)。本研究旨在構(gòu)建高效表達(dá)Ang-1腺病毒載體，觀察Ang-1在糖尿病大鼠腎臟中表達(dá)，為糖尿病腎病微血管病變的基因治療提供實驗依據(jù)。方法：①設(shè)計和合成引物，通過PCR從pMD18-Ang-1質(zhì)粒中擴增Ang-1基因；以In-Fusio交

2、換酶酶將EcoR I酶切PCR產(chǎn)物交換連接入同種酶切載體pDC315-GFP；并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，以陽性克隆為模板作菌落PCR鑒定和DNA測序鑒定。②穿梭質(zhì)粒pDC315-GFP-Ang-1在脂質(zhì)體介導(dǎo)下與輔助包裝質(zhì)粒pBHG lox△E1，3 Cre共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，終點稀釋法測定病毒滴度，擴增純化，觀察GFP熒光和Western Blot檢測目的蛋白的表達(dá)。③鏈脲佐菌素誘導(dǎo)糖尿病大鼠，尾靜脈注射Ang-1腺病毒，

3、連續(xù)不同時點取腎組織作免疫熒光、組化和RT-PCR分析Ang-1和Tie-2蛋白和基因表達(dá)。結(jié)果：①從質(zhì)粒pMD18-Ang-1中擴增、重組、酶切后獲得大約1558bp的片段，DNA測序結(jié)果與Genbank中報道的Ang-1基因序列一致。②重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞后可觀察GFP熒光表達(dá)，Western blot證實與GFP-Ang-1融合蛋白大小基本一致的陽性條帶；病毒滴度為1×1011 pfu/ml。③注射Ang-1腺病毒的糖尿病