甘蔗應(yīng)答黑穗病菌侵染的降解組分析及抗性相關(guān)miRNA靶標(biāo)挖掘.pdf

1、甘蔗黑穗病是一種由黑粉菌（Sporisorium scitamineum）引起的真菌病害。培育和推廣抗黑穗病甘蔗品種是控制該病害的最有效方法。長(zhǎng)期以來(lái)，人們從細(xì)胞學(xué)、形態(tài)學(xué)、生理生化抗性和分子互作機(jī)制等方面開(kāi)展了諸多研究，證明甘蔗與黑穗病菌的互作是一個(gè)復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)。本研究立足于甘蔗對(duì)黑穗病菌侵染的應(yīng)答反應(yīng)的全方位和多角度研究，首先，通過(guò)研究黑穗病菌在蔗芽組織中的數(shù)量及活性氧代謝途徑和苯丙烷代謝途徑關(guān)鍵酶活性的變化，分析甘蔗與黑穗病菌互

2、作的時(shí)間點(diǎn)，以更準(zhǔn)確地了解甘蔗有效應(yīng)答黑穗病菌侵染的時(shí)間和強(qiáng)度，確定互作的關(guān)鍵時(shí)間點(diǎn)；其次，利用降解組測(cè)序技術(shù)鑒定受 miRNA剪切調(diào)控的靶標(biāo)基因，分析靶標(biāo)基因的降解位點(diǎn)，結(jié)合靶標(biāo)基因的差異表達(dá)及功能分類，挖掘與抗病相關(guān)的靶標(biāo)基因；最后，對(duì)所篩選的差異靶標(biāo)基因及其對(duì)應(yīng)的miRNA進(jìn)行qRT-PCR表達(dá)分析，通過(guò)它們的表達(dá)趨勢(shì)和模式，進(jìn)一步確定 miRNA的剪切調(diào)控作用，并分析靶標(biāo)基因所涉及的代謝通路，以便進(jìn)一步了解甘蔗應(yīng)答黑穗病菌侵染的

3、響應(yīng)機(jī)制，為基于分子生物學(xué)技術(shù)改良甘蔗品種的抗黑穗病性提供靶標(biāo)基因及其相應(yīng)的miRNA資源。主要研究結(jié)果如下：
　　1.以YC05-179（抗黑穗病甘蔗品種）和ROC22（感黑穗病甘蔗品種）為研究材料，接種黑穗病菌（處理組）和無(wú)菌水（對(duì)照組）0d、1d、2d、3d、5d、7d后，采用熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)蔗芽組織中黑穗病菌的菌量變化情況，并測(cè)定活性氧代謝途徑關(guān)鍵酶（POD、SOD和CAT）和苯丙烷代謝途徑關(guān)鍵酶（PPO、PAL和T

4、AL）的活性變化。結(jié)果表明，接種黑穗病菌后，無(wú)論是YC05-179或是ROC22，蔗芽組織中黑穗病菌的菌量都隨接種時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，且ROC22中的菌量多于YC05-179相應(yīng)取樣時(shí)間點(diǎn)的菌量。此外，接種黑穗病菌后，YC05-179中POD、SOD和CAT的活性普遍比對(duì)照高，POD和CAT的活性也明顯高于ROC22的相應(yīng)取樣時(shí)間點(diǎn)，且活性峰值較早出現(xiàn)，表明YC05-179中活性氧代謝途徑強(qiáng)度比ROC22相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)高，能夠更早應(yīng)答黑穗病菌

5、的侵染。與此同時(shí)，接種黑穗病菌后，苯丙烷代謝途徑入口以TAL催化的通路為主，代謝途徑較弱，隨著接種時(shí)間的延長(zhǎng)，PAL和 TAL共同發(fā)揮作用，使得苯丙烷代謝途徑增強(qiáng)，且YC05-179中由PAL催化的通路啟動(dòng)較快。接種5 d時(shí)，蔗芽組織中活性氧代謝途徑和苯丙烷代謝途徑都較強(qiáng)，2d和3d次之，結(jié)合黑穗病菌的菌量在兩個(gè)品種接種2 d時(shí)即出現(xiàn)明顯差異，故認(rèn)為接種2 d和5 d是研究甘蔗與黑穗病菌互作過(guò)程中靶標(biāo)基因降解組測(cè)序的最佳時(shí)間點(diǎn)。

6、　　2.以YC05-179和ROC22的蔗芽組織為研究材料，以接種無(wú)菌水0 d的為對(duì)照，對(duì)接種黑穗病菌2 d和5 d的蔗芽進(jìn)行降解組測(cè)序分析。6個(gè)樣品共得到122.33 M原始數(shù)據(jù)量，經(jīng)數(shù)據(jù)評(píng)估后，各樣品的Q30在93％以上，且用于下游降解位點(diǎn)分析的序列與甘蔗的參考序列完全匹配，表明降解組測(cè)序質(zhì)量較高。6個(gè)甘蔗樣品共檢測(cè)到309個(gè)靶mRNA，分別與97個(gè)已知miRNA和112個(gè)新miRNA相呼應(yīng)，并鑒定了337處降解位點(diǎn)，表明miRNA

7、能夠有效剪切調(diào)控靶標(biāo)基因的多個(gè)位點(diǎn)。靶標(biāo)基因以Category0為主，涉及生命活動(dòng)的多種調(diào)控過(guò)程，如信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制（Signal transduction mechanisms）、離子轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制（Inorganic ion transport and metabolism）、防御機(jī)制（Defense mechanisms）、翻譯及翻譯后修飾（Translation, posttranslational modification）、能量的產(chǎn)生

8、與轉(zhuǎn)導(dǎo)（Energy production and conversion）、甘油酯類代謝（Glycerolipid metabolism）等。GO分析表明，兩個(gè)甘蔗品種中差異表達(dá)的靶標(biāo)基因的靶向分類基本一致，涉及到細(xì)胞（Cell）、膜（Membrane）、細(xì)胞器（Organelle）和細(xì)胞部分（Cell part）等細(xì)胞成分（Cellular component），主要發(fā)揮催化活性（Catalytic activity）和結(jié)合（Bind

9、ing）功能，可參與代謝過(guò)程（Metabolic process）、細(xì)胞生理過(guò)程（Cellular process）、單生物過(guò)程（Single-organism process）、應(yīng)答刺激（Response to stimulus）、生物學(xué)調(diào)控（Biological regulation）、免疫系統(tǒng)過(guò)程（Immune system process）和信號(hào)途徑（Signaling）等。KEGG富集分析顯示，差異表達(dá)靶標(biāo)基因參與植物激素信號(hào)

10、轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑（Plant hormone signal transduction）、輔酶Q和其他萜醌類化合物生物合成（Ubiquinone and other terpenoid-quinonebiosynthesis）、泛素介導(dǎo)的蛋白降解途徑（Ubiquitin mediated proteolysis）、植物與病原菌互作途徑（Plant-pathogen interaction）、氧化磷酸化作用（Oxidative phosphoryl

11、ation）、過(guò)氧化物酶體途徑（Peroxisome）、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸生物合成途徑（Phenylalanine, tyrosine and tryptophan biosynthesis）、吞噬體（Phagosome）等與抗病性相關(guān)的代謝通路。
　　3.差異表達(dá)靶標(biāo)基因及其對(duì)應(yīng)miRNA的qRT-PCR表達(dá)分析。靶標(biāo)基因和它們對(duì)應(yīng)的miRNA至少在一個(gè)甘蔗品種中表達(dá)模式相反，這種表達(dá)模式正符合miRNA對(duì)靶標(biāo)基因的剪切作

12、用。CCR參與木質(zhì)素生物合成途徑，在接種后表達(dá)量升高，有助于木質(zhì)素的合成與累積，有效應(yīng)答黑穗病菌的侵染；UCH-L5與泛素介導(dǎo)的蛋白降解途徑密切相關(guān)，也可參與應(yīng)答黑穗病菌的侵染；GK、MLO和 HIR1參與植物與病原菌的互作途徑，其中，GK具有NHO1活性，其表達(dá)量的升高可以增強(qiáng)甘蔗對(duì)黑穗病菌的抗性；此外，MLO還參與了鈣離子通路，與植物的抗病性表現(xiàn)出負(fù)相關(guān)；MLO基因的表達(dá)，在接種黑穗病菌后下降，減輕了MLO蛋白對(duì)防衛(wèi)反應(yīng)的抑制作用；

13、HIR參與植物的過(guò)敏反應(yīng)，接種黑穗病菌后，HIR1上調(diào)表達(dá)，蔗芽組織可以較早的發(fā)生過(guò)敏反應(yīng)，以限制黑穗病菌的繼續(xù)擴(kuò)展侵染；EIL3是乙烯信號(hào)途徑的轉(zhuǎn)錄因子，接種黑穗病菌后表達(dá)上調(diào)，使乙烯代謝途徑增強(qiáng)，有利于抵御黑穗病菌的侵染；ARF和AIP參與生長(zhǎng)素信號(hào)途徑，接種黑穗病菌后，ARF8下調(diào)表達(dá)，且YC05-179中ARF8的下降幅度比ROC22小，而AIP上調(diào)表達(dá)，且表達(dá)量的上升幅度比ROC22大，表明生長(zhǎng)素信號(hào)途徑可以應(yīng)答黑穗病菌侵染；

14、此外，GRF8的下調(diào)表達(dá)，說(shuō)明黑穗病菌的侵染在一定程度上抑制了甘蔗本身的生長(zhǎng)；SAMDC參與多胺的生物合成，黑穗病菌侵染后，SAMDC的表達(dá)增強(qiáng)，表明黑穗病菌的侵染可以促使多胺代謝途徑增強(qiáng)；MYB是典型的抗病相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子，MYB2在兩個(gè)品種中的表達(dá)趨勢(shì)不同，且在兩個(gè)品種中的應(yīng)答時(shí)間不同，表明MYB2對(duì)黑穗病菌侵染的應(yīng)答能力與甘蔗基因型的抗黑穗病性相關(guān)；AGO1B在兩個(gè)品種中表達(dá)模式相反，其中，YC05-179接種后表達(dá)下調(diào)，可以累積更多